26.09.2024
Falsche DNA in Ihrer qPCR? Vergleichende Beurteilung von Leaching-Werten in PCR-Platten
Rafal Grzeskowiak, Eppendorf SE
Sandrine Hamels, Eric Gancarek, Eppendorf Application Technologies S.A.
Diese Arbeit stellt eine vergleichende Analyse von UV-absorbierenden Leachables und qPCR-Fluoreszenzsignalen von Reinstwasser vor, welches in PCR-Platten mehrerer Hersteller analog einer PCR erhitzt wurde.
Die beobachteten Leaching-Werte und die daraus resultierenden falschen DNA-Konzentrationen waren beträchtlich und variierten deutlich in der Mehrzahl der getesteten, nicht von Eppendorf hergestellten Platten. Dies zeigt, dass Leaching qPCR-Assays stark beeinflussen und sowohl photometrische als auch auf Fluoreszenzsignalen beruhende Quantifizierungen beeinträchtigen kann, was zu schwer reproduzierbaren Ergebnissen führt.
Einleitung
Plastikverbrauchsartikel im Labor stellen einen integralen Teil eines jeden PCR-Arbeitsablaufes dar, und sie sind in der Lage, einen direkten und unter Umstanden schwerwiegenden Einfluss auf experimentelle Ergebnisse und die Validität der Daten auszuüben. Eine zunehmende Anzahl von Studien zeigt, dass ein großer Teil der Additive, die bei der Produktion beigemischt werden, aus dem Verbrauchsartikel in die Probe freigelassen werden (Leaching) und somit eine Fehlerquelle in verschiedenen Assay-Systemen einschließlich der PCR darstellen können.
Die Leaching-Effekte sind insbesondere im Zusammenhang mit in Platten ausgeführten Assays relevant, in welchen eine hohe Variabilität der Temperaturbedingungen sowie positionsabhängiges Leaching die Datenvalidität und die Reproduzierbarkeit eines PCR/qPCR-Assays dramatisch beeinflussen können.