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28.06.2022

17.03.2022

Mit Lichtblatt-Mikroskopie Pilz-Fruchtkörper am lebenden Objekt untersuchen

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Um Gewebe mikroskopisch zu untersuchen, muss man sie meist in dünne Scheiben schneiden. So lassen sich allerdings keine ganzen Gewebe oder lebenden Organismen analysieren. Genau das ist zwei mexikanischen Arbeitsgruppen in Zusammenarbeit mit Privatdozentin Dr. Ines Teichert vom Lehrstuhl Allgemeine und Molekulare Botanik der Ruhr-Universität Bochum (RUB) gelungen.

Sie nutzten dafür die Lichtblattmikroskopie und eine aus Bochum stammende Albinomutante des Hyphenpilzes Sordaria macrospora, einem gern genutzten Modellorganismus für die Untersuchung der Bildung von Fruchtkörpern. Die Gruppe berichtet in der Zeitschrift Journal of Biophotonics.

Optische Schnitte ohne Zerstörung

Zur Analyse von Geweben werden mikroskopische Techniken verwendet, die eine hohe Auflösung besitzen. Viele Methoden können allerdings nur bei dünnen Präparaten angewendet werden. Mithilfe der Lichtblattmikroskopie (light sheet microscopy, LSFM) werden in den Geweben sogenannte optische Schnitte erzeugt.

"Bei der LSFM wird mit Hilfe eines Beleuchtungsobjektivs ein Lichtblatt in die Probe hineinprojiziert", erklärt Ines Teichert. Ein senkrecht hierzu angeordnetes Detektionsobjektiv nimmt das emittierte Licht auf. Das Gewebe selbst wird durch die selektive Strahlung weniger geschädigt, und es können viele Bilder mit hoher optischer Auflösung in hoher Geschwindigkeit aufgenommen werden, sodass eine 3D-Rekonstruktion auch bei größerer Gewebetiefe möglich ist.

Ines Teichert schickte eine Albinomutante des Hyphenpilzes Sordaria macrospora mit einer Mutation in einem Melanin-Biosynthese-Gen und einem genetischen Zellkernmarker nach Ensenada, Mexiko, wo die Arbeitsgruppen für Optik unter der Leitung von Prof. Dr. Israel Rocha-Mendoza und für Mikrobiologie unter der Leitung von Prof. Dr. Meritxell Riquelme zusammenarbeiteten.

Sie hatten ein Lichtblattmikroskop für die Untersuchung von Proben verschiedener Größe bis zu über zehn Millimeter konstruiert, mit dem mikroskopisch kleine Zellen, Pilze, aber auch geklärte Maus-Hirne und Shrimp beobachtet werden können. Die Albinomutante erlaubte es den Forschenden, ihr Inneres von außen anzusehen, ohne eine Gewebe-Klärung vornehmen zu müssen.

Spezielle Lichtstrahlen

In einer früheren Studie hatten die mexikanischen Gruppen bereits die Lichtblattmikroskopie für die Aufnahme multifluoreszenter Bilder des Hyphenpilzes Neurospora crassa etabliert. Hier nutzten die Arbeitsgruppen Gauß-Strahlen für die Herstellung der Lichtblätter. Allerdings führen die intrinsischen optischen Eigenschaften der Gauß-Strahlen zu Beeinträchtigungen in der Beleuchtung der Probe, wenn große Gewebebereiche mikroskopiert werden. Diese Nachteile können durch die Verwendung von mehrfarbigen Bessel-Strahlen minimiert werden.

Der untersuchte Hyphenpilz ist ein genetisches Modellsystem für die Untersuchung der Fruchtkörperentwicklung und bildet zwei bis vier Millimeter große, birnenförmige schwarze Fruchtkörper. Die Arbeitsgruppen nutzten neben den herkömmlichen Gauß-Strahlen zur Erzeugung des Lichtblattes auch sogenannte Bessel-Strahlen.

Diese Strahlen sind nicht-beugend und selbst-heilend, sodass sie ihre Form während der Ausbreitung beibehalten. Durch diese optischen Eigenschaften entstehen homogene Lichtblätter, die eine gleichmäßige Ausleuchtung bewirken. Yryx Luna-Palacios, eine mexikanische Doktorandin, implementierte die Bessel-Strahl-Technik in das Lichtblatt-Mikroskop und beobachtete die S. macrospora-Fruchtkörper.

"Tatsächlich konnten wir mit den beiden Methoden gefärbte Zellwände und Zellkerne in jungen Fruchtkörpern beobachten", berichtet Ines Teichert. Mit den Bessel-Strahlen gelang es, noch größere Bereiche abzubilden. "Die Arbeit stellt eine proof-of-concept-Studie dar", so die Forscherin. "Jetzt, wo wir wissen, dass man lebende Pilze mit der Lichtblattmikroskopie untersuchen kann, können wir weitere Fragen in Betracht ziehen." Interessant seien etwa Fragen, welche Proteine sich wo in lebenden Fruchtkörpern der Pilze finden, wie also neue Gewebe entstehen.

» Originalpublikation

Quelle: Universität Bochum