12.09.2024
Wichtige Aspekte der Probenvorbereitung von biologischen Materialien - vom Zellaufschluss bis zur Homogenisierung und Pulverisierung
Biologische Proben kommen in allen Formen und Konsistenzen vor: harte Knochen, zähe, faserige Pflanzen, weiches Muskel-, Tumor- oder Lebergewebe. Ganz zu schweigen von den Millionen Zellen, wie z. B. Hefe, Bakterien oder Algen, welche aufgeschlossen werden, um die DNA oder RNA zu isolieren oder Proteine zu extrahieren.
Für Forschungen in der Genomik, Transkriptomik oder Metabolomik werden alle Arten von biologischen Proben aufbereitet, die Probenvorbereitung ist der erste Schritt in jedem analytischen Prozess. RETSCH bietet ein breites Programm an Brechern und Mühlen für die reproduzierbare Pulverisierung von Feststoffproben; einige Modelle sind für den Zellaufschluss und die Homogenisierung biologischer Proben bestens geeignet.
Zellaufschluss von Hefe, Mikroalgen und Bakterien (in Suspension)
Der Zellaufschluss von Bakterien, Hefe, Fadenpilzen oder Mikroalgen ist ein Standardverfahren sowohl in der biologischen Grundlagenforschung als auch in der angewandten Biotechnologie und der medizinischen Forschung, um an Nukleinsäuren (DNA, RNA), Zellproteine oder Metabolite zu gelangen. Verschiedene Methoden eignen sich für den Zellaufschluss im Labormaßstab. Sie nutzen entweder Chemikalien oder mechanische Kräfte, um die Zellmembran und -struktur zu zerstören. Die mechanischen Verfahren ermöglichen die Zerstörung selbst dicker Zellwände, z. B. von Bacillus Sporen oder Mycobacterium Zellen, welche sich nur schwer lysieren lassen. Eine Zugabe von Chemikalien, welche die nachfolgende Extraktion beeinträchtigen könnte, ist nicht notwendig.
Bead Beating ist eine weit verbreitete und sehr effektive mechanische Methode für den Zellaufschluss, bei der Kügelchen aus Glas, Keramik oder Stahl eingesetzt werden. Diese werden gründlich mit der Zellsuspension durch Rühren oder Schütteln vermischt; Scherkräfte, die durch die große Oberfläche der Glaskügelchen entstehen, brechen die Zellwände auf und die Zellkomponenten treten aus. Bead Beating wird häufig für den Zellaufschluss in 2 ml Einweg-Reaktionsgefäßen genutzt, lässt sich aber auch in größerem Maßstab, z. B. in 50 ml Falcon® Tubes durchführen. Vorteile gegenüber anderen mechanischen Methoden wie z. B. der Sonifikation sind die einfache Durchführung, die Möglichkeit, mehrere Proben in einem Schritt zu bearbeiten, ohne das Risiko der Kreuzkontamination und der bessere Ertrag an Zellkomponenten.
Das einfachste Bead Beating Verfahren besteht in der Mischung von Zellsuspension mit gleichem Volumenanteil Kügelchen und dem Einsatz eines Vortex Mixers. Diese Methode ist allerdings zeitaufwändig und fehleranfällig, besonders bei hohem Probendurchsatz oder bei Aufschlusszeiten von bis zu 10 Minuten. Die RETSCH Schwingmühle MM 400 kann mit unterschiedlichen Adaptern betrieben werden, was den Zellaufschluss schnell, effizient und reproduzierbar macht. Die Zellen werden automatisch aufgebrochen und der Laborant gewinnt Zeit für andere Aufgaben.
Für die Isolierung von DNA oder RNA wird üblicherweise weniger als 1 ml Zellmaterial benötigt, daher wird der Zellaufschluss häufig in 1,5 ml oder 2 ml Reaktionsgefäßen durchgeführt. RETSCH bietet verschiedene Adapter für diese Gefäße an, so dass bis zu 20 Proben in einem Arbeitsgang homogenisiert werden können. Für die Extraktion von Proteinen oder Metaboliten werden jedoch größere Mengen an Zellsuspension benötigt; hierfür sind 50 ml Zentrifugenröhrchen (Falcon® Tubes) geeignet. In der MM 400 lassen sich 8 Proben à 30 ml Zellsuspension mithilfe eines Adapters simultan aufbereiten. Die fehlende Größe zwischen 2 ml und 50 ml ist jetzt mit den neuen 5 ml Eppendorf Tubes erhältlich, welche ebenfalls in der MM 400 verwendet werden können.
Fallbeispiel: Zellaufschluss von Saccharomyces cerevisiae
- Abb.1: Gesamtproteinkonzentration nach Zellauf-
schluss mit der Schwingmühle MM 400 bzw. einem
Vortexer, wird der benötigte Proteinertrag nach
7 min (MM 400) bzw. 12 min (Vortexer) erreicht
Beim Vortexen von 4 g Hefezellen mit 12 g Pufferlösung und 16 g Glaskügelchen (0,5 mm - 0,75 mm) in 50 ml Falcon® Tubes wurden die Proben 12-mal für 1 Minute geschüttelt, mit jeweils 1 Minute Zwischenkühlung auf Eis, um ausreichend Proteine zu erhalten. Der simultane Aufschluss von mehr als 2 Proben war nur möglich, indem mehrere Personen mehrere Vortexer in einer Reihe bearbeiten. Zudem war es erforderlich, die Proben unter den Anwendern auszutauschen, um anwenderspezifische und hardwarespezifische Unterschiede auszugleichen.
Der Einsatz der Schwingmühle MM 400 vereinfacht die Laborarbeit deutlich. Mit dieser Mühle werden mehrere Zellsuspensionen automatisch bei 30 Hz aufgeschlossen. Im Vergleich konnte die benötigte Zeit auf 7 Minuten reduziert werden, mit deutlich besseren Proteinerträgen als beim Vortexen (Abbildung 1). Ein weiterer Vorteil der automatisierten Methode ist der geringe Temperaturanstieg in der Zellsuspension während des Aufschlusses sowie die bessere Reproduzierbarkeit (Abbildung 2 und 3).
Abb.2: Temperaturanstieg während Zellaufschluss in der MM 400 (bei 30 Hz) und mit Vortexer,
Kühlung auf Eis nach jeder Minute Zellaufschluss
Abb.3: Bessere Reproduzierbarkeit der Gesamtproteinkonzentration nach Zellaufschluss,
7 min in der MM 400; 12 min Vortex; Fehlerbalken: % Standardabweichung
- Abb.4: Temperaturanstieg, 7 min in der MM 400
bei 20 Hz oder 30 Hz, keine
Zwischenkühlung auf Eis
Der Hefezellenaufschluss wurde durch das Variieren der Frequenz und der Kugelgröße optimiert. Für die Extraktion der Proteine war es vorteilhaft, die Frequenz auf 20 Hz zu reduzieren, was die Schaumbildung reduzierte und einen leichten Anstieg des Gesamtproteingehalts bewirkte. Zudem war der Temperaturanstieg bei 20 Hz geringer als bei 30 Hz (Abbildung 4).
In einem weiteren Versuch wurde der Hefezellenaufschluss in der MM 400 mit dem Verfahren der Sonifikation verglichen. Ein weiterer Vergleich bezog sich auf die Proteinkonzentration nach Zellaufschluss in 2 ml Reaktionsgefäßen und in 50 ml Zentrifugenröhrchen. Nach 5 Minuten war der Proteinertrag durch Bead Beating ca. 6-mal höher als der Ertrag durch Sonifikation (Ergebnisse nicht dargestellt). Der Unterschied zwischen 1 ml Zellsuspension (2 ml Reaktionsgefäß) und 25 ml Zellsuspension (Zentrifugenröhrchen) war minimal.
Abb.5: Optimierung des Zellaufschlusses in der MM 400 durch Nutzung von Kugelgrößen zwischen 0,75 und 1 mm führt zu höchster Proteinkonzentration (links); die Proteinkonzentration wird von der Anzahl der Kügelchen beeinflusst (rechts).
Fallbeispiel: Zellaufschluss von Mikroalgen
Der Zellaufschluss von Mikroalgen kann eine Herausforderung darstellen, da die Zellen den Schereffekten der Glaskugeln eher widerstehen. So war z. B. der Aufschluss von Kieselalgen mit einem Schüttler und Glaskugeln in der Vergangenheit nicht erfolgreich und die Zellen wurden mithilfe einer French Press aufgeschlossen. Mit der MM 400 in Kombination mit einem Adapter für konische Zentrifugenröhrchen hingegen lassen sich Zellen von Mikroalgen erfolgreich aufschließen. 300 ml Zellsuspension des Organismus Thalassiosira pseudonana wurden zentrifugiert, in 20 ml Pufferlösung suspendiert und in ein 50 ml Falcon® Tube gefüllt. 40 ml Glaskügelchen (90 μm bis 150 μm und 300 μm bis 400 μm, Verhältnis 1:1) wurden hinzugefügt und der Zellaufschluss wurde für 20 Sekunden bei 20 Hz durchgeführt. Durch das Mikroskop ließ sich der vollständige Zellaufschluss erkennen (Abbildung 6).
Abb.6: Zellen der Kieselalge Thalassiosira pseudonana vor (links) und nach dem Aufschluss (rechts) mit der Schwingmühle MM 400 in Kombination mit dem Adapter für konische Zentrifugenröhrchen, 20 Sek bei 20 Hz.
Abb.7: Phaeodactylum tricornutum Zellen vor (links) und nach dem Zellaufschluss (rechts) in der Schwingmühle MM 400 in Kombination mit einem Adapter für Zentrifugenröhrchen, 3 x 60 Sek bei 30 Hz.
Die Homogenisierung von weichen und zähen biologischen Proben wie Sputum oder Leber wurde bereits in einem früheren Fachartikel beschrieben
Kryogenvermahlung von Zellpellets, Muskelgewebe und Kiefernnadeln
Bei Proben wie faserigen Pflanzen, sehr zähen Venen, Fingernägeln, oder zäherem Gewebe ist die Homogenisierung in Pufferlösung nicht sehr effektiv. Die Kryogenvermahlung dagegen, also die Versprödung von Proben mit Flüssigstickstoff (LN2) oder Trockeneis vor oder während der Zerkleinerung, ist eine sehr effektive Methode zur Gewinnung homogener Proben. Anders als beim Bead Beating Prozess ist die Methode des Einfrierens der Probe geeignet, um intrazelluläre Organellen aufzubrechen, z. B. bei Hefe. Dank der niedrigen Temperatur kommt es nicht zu einer Zersetzung z. B. von Proteinen und der Verlust leicht flüchtiger Bestandteile wird drastisch reduziert. Für klebrige Proben ist die Kryogenvermahlung oft die einzige Möglichkeit, eine homogene Probe zu produzieren. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die Probenmaterialien, die mit der MM 400 oder der CryoMill erfolgreich kryogen pulverisiert wurden (siehe auch Abbildung 8).
Abb.8: Fleischstücke (oben links) und klebrige Beeren (oben rechts) vor und nach der Kryogenvermahlung, Kiefernnadeln (unten) vor und nach der Kryogenvermahlung (inkl. Agarosegel für die RNA Separation; hohe Reproduzierbarkeit, ausreichende Menge von aufbereiteter RNA nach der Vermahlung)
Geeignete Mühlen für die Kryogenvermahlung
Für kleine Probenmengen ist der Einsatz der MM 400 oder der CryoMill sehr effektiv. Geeignete Mahlbecher der MM 400 sind aus Stahl oder PTFE; außerdem können 1,5 ml und 2 ml Einweggefäße genutzt werden. Es ist darauf zu achten, dass kein Flüssigstickstoff in den Mahlbechern oder Reaktionsgefäßen eingeschlossen wird. Die bei der Vermahlung entstehende Wärme macht den Flüssigstickstoff gasförmig, was zu einem deutlichen Druckanstieg im Mahlbecher führt. Mithilfe einer Zange wird der geschlossene Mahlbecher für 2 bis 3 Minuten in einen mit LN2 gefüllten Isolierbehälter getaucht und dann in die MM 400 eingespannt. Damit der hohe Energieeintrag und die daraus resultierende Reibungswärme die Probe nicht zu stark erwärmen und so das Bruchverhalten beeinträchtigen, sollte der Mahlprozess nicht länger als 2 Minuten dauern. Sollte mehr Zeit nötig sein, muss die Vermahlung durch Zwischenkühlungen des geschlossenen Mahlbechers unterbrochen werden.
Die CryoMill von RETSCH bietet den Vorteil der kontinuierlichen Kühlung des Mahlbechers mit Flüssigstickstoff, wodurch die Temperatur des Bechers und der Probe innerhalb von Minuten auf gleichbleibende -196 °C gesenkt wird. Die Temperatur bleibt auch bei längerer Mahldauer konstant. Wenn Zwischenkühlung erforderlich ist, können entsprechende Zyklen von Vermahlung und Kühlung programmiert werden. Der Mahlbecher bleibt währenddessen in der Mühle eingespannt, was die Handhabung sehr unkompliziert macht. Zudem kommt der Anwender zu keinem Zeitpunkt mit dem flüssigen Stickstoff in Berührung, so dass die Bedienung der CryoMill sehr sicher und bedienerfreundlich ist. Die automatische Vorkühlung stellt sicher, dass die Vermahlung nicht beginnt, bevor eine Temperatur von -196 °C erreicht und gehalten wird. Für die schwermetallfreie Zerkleinerung wird ein Mahlbecher aus Zirkonoxid genutzt.
Pulverisierung forensischer Proben: Knochen, Zähne, Haare
Forensische Materialien wie Haare, Knochen oder Zähne sind i. d. R. spröde und benötigen daher keine Kühlung vor der Zerkleinerung. Je nach gewünschter Endfeinheit müssen die Proben gegebenenfalls in einem Backenbrecher oder einer Schneidmühle vorzerkleinert werden, um Partikelgrößen zu erhalten, die für die Vermahlung in einer Kugelmühle geeignet sind (<10 mm). Schneidmühlen werden für die Vorzerkleinerung von Knochen eingesetzt, die frisch und eventuell nicht komplett getrocknet sind bzw. noch Fleischreste aufweisen. RETSCH bietet verschiedene Schneidmühlen für die Zerkleinerung weicher, mittelharter, zäher und faseriger Proben an. Die Auswahl an Zubehör erlaubt die Anpassung an eine Vielzahl unterschiedlicher Applikationen. Die SM 300 kann mit 3 verschiedenen Rotoren und mit Bodensieben von 0,25 mm bis 20 mm ausgestattet werden.
Im Gegensatz zu den frischen lassen sich trockene Knochen auf eine Feinheit von <0,25 mm in ein bis zwei Schritten zerkleinern. Zur optimalen Anpassung an das Bruchverhalten und die Temperaturempfindlichkeit der Probe verfügt die SM 300 über eine variable Drehzahl von 100 bis 3000 min-1 und ist zudem kraftvoll genug, auch sehr zähe Knochen zu vermahlen.
Anwendungsbeispiel Knochen
Im folgenden Beispiel wurden 700 g Knochen in der SM 300 mit einem 6-ScheibenRotor und einem Bodensieb mit Öffnungsweite 6 mm vorzerkleinert. Nach ungefähr 30 Sekunden Zerkleinerung bei 3000 min-1 wurden Partikelgrößen unter 6 mm erzielt (Abbildung 9).
Abb. 9: Knochen vor und nach der Zerkleinerung in der SM 300
Anwendungsbeispiel Zähne
Ein weiteres Beispiel ist die Aufbereitung von Zähnen. Ein Zahn wurde in einen 25 ml Mahlbecher aus Zirkonoxid gegeben und unter Verwendung einer 20 mm Mahlkugel aus demselben Material pulverisiert. Nach 3 min bei 30 Hz in der MM 400 wies die Probe eine Partikelgröße von überwiegend <100 μm auf (Abbildung 10, rechts).
Abb.10: Zähne vor und nach der Vermahlung in der Schwingmühle MM 400
Anwendungsbeispiel Haare
Die MM 400 und CryoMill eignen sich auch zur Vermahlung von faserigen Proben wie Haaren. Interessanterweise muss gesundes Haar oft kryogen vermahlen werden, während ungesundes Haar sich leicht bei Raumtemperatur zerkleinern lässt. Im Gegensatz zu den eher kompakten Knochen und Zähnen wird Haar am besten mit kleinen Mahlkugeln zerkleinert, da für diesen Prozess eher Reibung als Prall benötigt wird. Dabei sollte die Mahldauer möglichst kurzgehalten werden, da die Proben leicht verbrennen.
1 g Haar wird in einem 25 ml Mahlbecher aus rostfreiem Stahl mit 6 Mahlkugeln à 10 mm aus demselben Material vermahlen. Nach 2 min bei 25 Hz liegt die Feinheit der Probe bei <160 mm (Abbildung 11, rechts), was für die nachfolgende Analytik (z. B. auf Drogenkonsum) ausreichend ist.
Abb.11: Menschliches Haar vor und nach der Vermahlung in der Schwingmühle MM 400
Neue Methode zum Abwaschen intakter Bakterienzellen von menschlichem Gewebe
- Abb.12: Schwingmühle MM 400 (links)mit Adapter
für 8 x 50 ml Zentrifugenröhrchen (unten)
und weiteren Adaptern für Einweg-Reaktionsgefäße;
CryoMill (rechts oben); Schneidmühle SM 300 (links)
Bei den Hüftgelenksimplantaten kommt es innerhalb der ersten 2 Jahre nach der ersten Operation in weniger als 1 % aller Fälle zur Infektion, bei Kniegelenksersatz sind es unter 2 % und bei Ellbogenersatz sogar unter 7 %. Es wird jedoch davon ausgegangen, dass einige Infektionen als aseptische Revisionen klassifiziert werden, so dass der Prozentsatz der PJI tatsächlich deutlich höher ausfällt. PJI kann innerhalb von 3 Tagen nach der Operation auftreten, aber auch noch Jahre später.
Da die Infektion von sehr unterschiedlichen Mikroorganismen verursacht werden kann, ist die Klassifizierung für qualitative Therapien sehr komplex. Je nach angewandter Methode ist die Dokumentationsrate leider begrenzt; in vielen Fällen kann die Infektion nicht mit traditionellen Methoden dokumentiert werden. Hier kommt die Schwingmühle MM 400 ins Spiel.
Das Verfahren ist sehr einfach: Keime werden von Gewebeproben mit 20 ml sterilem Wasser und 5 ml Glaskugeln à 1 mm bei 30 Hz in einem autoklavierten Stahlbecher in der MM 400 innerhalb von 210 Sekunden abgewaschen. Für diese Prozedur werden sterile 30 ml Einwegflaschen verwendet, welche sich direkt in die Schwingmühle einspannen lassen oder in einen Adapter der vier dieser Flaschen pro Mahlstelle aufnehmen kann. Der Überstand kann dann entweder auf Platten zur Inkubation ausgestrichen oder direkt in Flüssigmedium kultiviert werden. Auch eine Diagnostik mittels PCR (Polymerase Chain Reaction) ist möglich. Mit dieser Methode nach A.-L. Roux et. al (2010) wird eine gute Dokumentationsrate erzielt. Sie kann im Prinzip für jedes infizierte Gewebe genutzt werden, auch wenn kein Implantat vorliegt.
Fazit
Vom "Bead Beating" für den Zellaufschluss über die Pulverisierung und Homogenisierung bis hin zur Kryogenvermahlung bietet RETSCH zuverlässige und komfortable Lösungen für die Probenvorbereitung in Bereichen wie Biotechnologie, Diagnostik, Forensik, Mikrobiologie und Agrarwissenschaften.