01.08.2024
Mikroplastik-Analytik: Der lange Weg zum Detektions-Standard - Identifikation von Fehlerquellen und die Chance der Fluoreszenz-Mikroskopie
Sophia Olbrich, Katrin Schuhen; et al , Wasser 3.0
Dennis Gövert, Hochschule Mannheim
Mikroplastik wurde bereits an zahlreichen Orten in unserer Umwelt gefunden und das nicht nur in Gewässern, sondern auch in Luft und Boden. Über unterschiedliche Aufnahmewege, wie zum Beispiel die Nahrung, Wasser oder Atemluft, findet das Mikroplastik auch den Weg in den menschlichen Organismus [1].
Um Mikroplastikbelastungen einschätzen und Risiken besser bewerten zu können, ist es wichtig, Mikroplastik nicht nur "zu finden", sondern Mikroplastik-Belastung zu analysieren und die Auswirkungen von Mikroplastik zu erforschen.
Obwohl das Daten sammeln zu Mikroplastik-Belastungen kontinuierlich voranschreitet, fehlte es bisher an der Vereinheitlichung der Prozesse, sodass nicht nur Datenmassen, sondern auch nicht vergleichbare Daten entstehen. Hinzu kommt, dass die Mikroplastik-Detektion auf einem fehleranfälligen mehrstufigen Prozess aufbaut, der nicht erst mit dem analytischen Auswertungsgerät beginnt.
Es stellt sich demnach einmal mehr die Frage: Wie können wir Mikroplastik vergleichbar und kostengünstig detektieren?
Um diese Frage wissenschaftlich korrekt zu beantworten, ist es nötig, mehrere Prozessschritte einzeln und im Ganzen zu betrachten. Der Gesamtprozess lässt sich in vier Stufen unterteilen (Abbildung 1). Die Probennahme kann an den verschiedensten Standorten stattfinden, wobei im beschriebenen Anwendungsfall der Fokus auf Abwässer und Gewässer gelegt wird [2].
Abb.1: Gegenüberstellung der aktuellen Variationsmöglichkeiten in der MP Analytik [3]
- Abb.2: Fluoreszenzmarker (oben) und
angefärbtes Mikroplastik unter dem Fluor-
eszenzmikroskop (unten) (©Wasser 3.0)
Nach der Probenaufarbeitung erfolgt die Detektion der Mikroplastik-Partikel. Als Detektionsmethode wurde in dieser Studie auf Fluoreszenz-Mikroskopie gesetzt. Als Fluoreszenzmarker wurde abcr eco Wasser 3.0 detect mix MP-1 (AB930015) verwendet.
Dieser Marker konnte in langjähriger Forschung entwickelt werden, um selektiv Mikroplastik anzufärben [2], [6], [7]. Gegenüber anderen Methoden zur Charakterisierung liegt der Vorteil von Fluoreszenzmikroskopie in der Schnelligkeit und Mess-Effizienz.
Aus dem Optimierungs- und Standardisierungsschritten ergibt sich ein Mehrschrittprotokoll bis zum Erhalt eines Ergebnisses (Abbildung 3).
- Abb.3: Übersicht der einzelnen Schritte
der MP-Analytik (mit den Standardprotokollen
von Wasser 3.0) (eigene Darstellung)
Herausforderungen meistern, Fehlerquellen eliminieren!
Fehlerquellen und Herausforderungen sind nicht erst auf der Stufe der Detektion präsent (Abbildung 4). In jedem einzelnen Schritt von der Probennahme bis zur Detektion können Fehler passieren, die unmittelbaren Einfluss auf das Messergebnis haben. Gerade bei der Erarbeitung eines Detektionsstandards ist es wichtig, das Anforderungsprofil an die Mikroplastik-Analytik zu definieren und mehrere Methoden vergleichend zu prüfen. Methoden-übergreifende KI-gestützte Auswertungsmodelle können beim Datenmanagement helfen.
- Abb.4: Fehlerquellen und Herausforderungen
der Mikroplastik-Analytik [4], [8], [9]
Schnelle, robuste, kostengünstige Verfahren werden dringend benötigt, um die Fehlerquellen verfahrens- und methodenseitig zu eliminieren. Dazu gehört auch, dass man Ergebnisse vermehrt hinterfragt und vergleichende Analysen anfordert. Mit der hier vorgestellten Studie erhöhen wir die Transparenz und teilen unser Wissen und neusten Erkenntnisse aus dem Bereich der Mikroplastik-Analytik.
Material und Methoden
Probennahme
- Abb.5: Mobile Particle Sampling Unit
(PSU) von Wasser 3.0
Ebenso wurden mittels einer 0,5 L-Probenahmeflasche eine direkte Stichprobe aus dem Gewässer entnommen, was eine einfach handhabbare und schnelle Methode darstellt. Bei jeder Probennahme wurden zwei Proben nacheinander genommen (P1 und P2).
Probenaufbereitung
Bei der Probenaufbereitung, bei welcher 500 mL Probe für die Detektion vorbereitet werden, wurde die Probe mit Wasserstoffperoxid behandelt, welches für den Aufschluss natürlicher Partikel sorgt und das Mikroplastik nicht oder nur geringfügig angreift. Um das Mikroplastik in der Probe anzufärben, wurden 25 µL des Fluoreszenzmarkers abcr eco Wasser 3.0 detect mix MP-1 hinzugegeben und die Probe über einen schwarzen Membranfilter filtriert [7]. Zur Untersuchung der Reproduzierbarkeit wurde jede Probe zweimal aufgearbeitet.
Detektion
Der Filter mit der angefärbten Probe wird zur Detektion unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Zum einen wurde hierbei ein Fluoreszenzmikroskop der Firma Zeiss (Axio Zoom.v16) genutzt, welches vollautomatisiert Fluoreszenzaufnahmen aufnehmen kann. Zusätzlich wurden Aufnahmen mit einem Lichtmikroskop der Firma Leica (DMS 300) angefertigt, welches für die Fluoreszenzmikroskopie modifiziert wurde und somit eine deutlich kostengünstigere Alternative bietet (Abbildung 6).
Abb.6: Automatisiertes Fluoreszenz-Mikroskop (links). Für Fluoreszenzaufnahmen modifiziertes Mikroskop (Mitte, 1), welches mit einer LED-Taschenlampe an einem Greifarm (2) und einem Emissionsfilter (3) modifiziert wurde. Auch ist das Leica Mikroskop mit eingeschalteter LED-Taschenlampe, welche die Probe anstrahlt, zu sehen. Während der Aufnahmen wurde vor die Lampe ein blauer Bandpassfilter gehalten (4). (©Wasser 3.0)
- Abb.7: Darstellung der einzelnen Quadrate
auf dem gesamten Filter. (©Wasser 3.0)
Die Aufnahmen des gesamten Filters ermöglichen eine Gegenüberstellung mit den aufgenommenen Quadraten, sodass analysiert werden kann, wie repräsentativ diese die gesamte Filterfläche abbilden (Abbildung 7). Um das mit dem Zeiss Mikroskop aufgenommene Quadrat auch unter dem Leica Mikroskop zu finden, wurde es nach der Aufnahme farbig markiert, sodass mit diesem Mikroskop dasselbe Bild aufgenommen werden konnte und somit ein direkter Vergleich der detektierten Partikel möglich ist.
Ergebnisse und Diskussion
Kontaminationskontrolle
Zur Vermeidung von Mikroplastik-Einträgen aus der Umgebung (Luft, Kleidung, Gefäße, Labor) wurden ausschließlich Geräte aus Glas oder Metall genutzt und diese mit Aluminiumfolie abgedeckt. Gearbeitet wurde mit einem fusselarmen Schutzanzug, der vor Eintritt in das Labor mit einer Fusselrolle von Partikeln befreit wurde. Die Arbeitsflächen wurden zusätzlich mit einem fusselarmen Schwammtuch gereinigt und ein HEPA-Luftfilter sowie eine Luftschleuse eingesetzt. Ebenfalls wurden Blindproben zur Kontaminationskontrolle gemessen [5]. Hierzu wurden in Arbeitsumgebungen für eine Woche weiße Filter platziert, auf denen sich Staubpartikel und Kleidungsfasern absetzen können und anschließend unter dem Mikroskop ausgezählt werden konnten (Abbildung 8). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Abb.8: Mikroskop-Aufnahmen von weißen Rundfiltern nach einer Woche in einer Standard-Laborumgebung und der optimierten Laborumgebung (Mikroplastik Labor)(©Wasser 3.0)
Tab.1: Vergleich der gefunden Staubpartikel und Kleidungsfasern auf den 47 mm Rundfiltern aus drei verschiedenen Umgebungen.
Standardisierte Probennahme
Sowohl die Probennahme mittels Probennahmeflasche als auch mit Hilfe der PSU stellen leicht handhabbare Methoden dar, die als standardisierte Verfahren angewendet werden können und vergleichbare Proben liefern. Hierbei ist bei der Probennahmeflasche anzumerken, dass es sich durch das vergleichbar kleine Probenvolumen um eine Stichprobe handelt.
Dies kann dazu führen, dass aufgrund der Inhomogenität des Mikroplastiks im Gewässer stärkere Abweichungen in der Mikroplastikbelastung auftreten können. Diese Methode eignet sich insbesondere dafür, an zahlreichen Ort ohne hohen Kosten- oder Zeitaufwand Proben zu nehmen und eine flächendeckende Analyse der Mikroplastikbelastung zu gewinnen (siehe hierzu Mikroplastik Mapping und die Wasser 3.0 App, die später erläutert werden).
Auch die PSU gewährleistet eine Probennahme an verschiedenen Standorten und bietet den Vorteil des größeren Probevolumens, ist jedoch im Vergleich zur Beprobung mit der Probennahmeflasche aufwändiger zu transportieren und aufzubauen.
Vergleich der Detektion mit zwei Fluoreszenzmikroskopen
Die Ergebnisse der verwendeten Mikroskope lassen sich direkt gegenüberstellen, da durch Markierung der einzelnen Quadrate jeweils dieselben Aufnahmen getätigt werden konnten (Abbildung 9). Die resultierenden Abweichungen sind in Tabelle 2 dargestellt.
Abb.9: Vergleich der Auflicht- und Fluoreszenzaufnahmen der beiden Mikroskope. Auf der linken Seite sind die aufgenommenen Bilder eines Quadrates mit Lichtmikroskopie (oben) und Fluoreszenzmikroskopie (unten) mit dem Zeiss Mikroskop gezeigt. Während dieser Aufnahmen wurde das Quadrat farbig (grüner Punkt) markiert, was auf der anschließenden Aufnahme desselben Quadrates mit dem Leica Mikroskop (rechts) zu erkennen ist. (©Wasser 3.0)
Tab.2: Vergleich der Abweichung detektierten Partikel zwischen den Mikroskopen, Proben, Aufarbeitungen und Aufnahmen.
Inhomogene Verteilung des Mikroplastiks
Vergleicht man die erste und zweiten Aufbereitung derselben Probe, beträgt die Abweichung 43,7 ± 23,8 %. Dies ist auf die Herausforderung der Inhomogenität des Mikroplastiks in der Probe zurückzuführen. Selbst durch starkes Schütteln der Probe für 60 Sekunden vor Überführung in ein weiteres Gefäß kann nicht gewährleistet werden, dass die Partikel homogen verteilt sind und so gleichmäßig überführt werden.
Die Abweichung zwischen zwei mit der PSU direkt hintereinander genommenen Proben (P1 und P2) aus demselben Gewässer liegt bei 25,8 ± 17,5 %. Auch hier ist auf die Inhomogenität des Mikroplastiks zu verweisen, welche nicht nur innerhalb der Probe, sondern auch im Gewässer zu erkennen ist. Es ist anzumerken, dass die Abweichung zwischen den zwei Proben geringer ist als die Abweichung innerhalb derselben Probe.
- Abb.10: Aufnahme des gesamten Filters
mittels Fluoreszenzmikroskopie (©Wasser 3.0)
Nach der Filtration der Probe auf den schwarzen Membranfilter liegt das Mikroplastik nicht gleichmäßig verteilt vor (Abbildung 10), sodass es bei der Aufnahme des gesamten Filters im Vergleich zu einzelnen Quadraten zu den genannten Abweichungen kommt. So wurde zum Beispiel nach dem Auszählen von fünf Quadraten eine Belastung von 4,6 MP/L, bei zehn Quadraten von 6,5 MP/L und beim gesamten Filter 7,1 MP/L in einer ausgewählten Probe festgestellt.
Betrachtet man die beiden Methoden - das Aufnehmen einzelner Quadrate oder des gesamten Filters - hinsichtlich des Zeitaufwands, liegt der Vorteil bei der Auswertung der Quadrate. Während eine Aufnahme des gesamten Filters ungefähr 25 bis 30 Minuten in Anspruch nimmt, erhält man im anderen Fall die Ergebnisse in wenigen Minuten.
Durch die präsentierten Ergebnisse wird deutlich, dass die inhomogene Verteilung von Mikroplastik zahlreiche Herausforderungen in der Detektion bringt. Die Inhomogenität beeinflusst bereits die Probenahme und erschwert eine repräsentative Probenahme, besonders bei der Entnahme einer Stichprobe. Es wird daher empfohlen, mehrere Proben desselben Standortes zu analysieren, um ein repräsentativeres Ergebnis der Mikroplastikbelastung zu erhalten. Auch bei der Analyse der angefärbten Probe auf dem Filter mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt sich diese Problematik. Diese ist nur mit einem Kompromiss zu lösen, indem man zwischen analysierter Filterfläche und Genauigkeit der Ergebnisse sowie dem Zeitaufwand die beste Korrelation ermittelt.
Ein Weg entsteht, wenn man ihn geht...
Die Kontaminationskontrolle hat ergeben, dass die eingesetzten Methoden zur Verringerung von Partikeleinträgen über die Luft einen deutlichen Unterschied in der Anzahl an detektierten Partikeln und Fasern erbringen. Besonders Luftschleuse und Schutzanzüge konnten im Vergleich zum Standard-Labor eine deutliche Senkung der Fasern und Partikel hervorrufen.
Die von Wasser 3.0 entwickelten Standardverfahren zur Probennahme und -aufbereitung bieten die Möglichkeit von vergleichbaren Daten der Mikroplastikbelastung an verschiedensten Standorten. Mit der PSU steht eine Methode zur Entnahme einer repräsentativen Probenmenge zur Verfügung. Mittels Probennahmeflasche kann eine Stichprobe zur ersten Einschätzung der Kontamination entnommen werden.
Die Mikroplastik-Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie benötigt kein vollautomatisiertes Mikroskop. Fluoreszenzmikroskopie lässt sich auch kostengünstig durch Modifikation eines Licht-Mikroskops anwenden. Der Vorteil einer Automatisierung des Messprozesses liegt in der Messschnelligkeit und somit im höheren Probendurchsatz. Um die Vergleichbarkeit verschiedener Fluoreszenzmikroskope zu erhöhen, braucht es eine Methode zum Abgleich der Helligkeitswerte der Fluoreszenzsignale.
Bei der mehrfachen Detektion der Partikel einer Probe kam es zu Abweichungen. Selbst durch starkes Durchmischen der Probe vor der Entnahme einer Teilprobe lässt sich die inhomogene Verteilung des Mikroplastiks in der Probe nicht verhindern. Es ist ratsam mindestens mehrere Proben (mindestens zwei) zu analysieren, um verlässliche Daten zur Mikroplastikbelastung zu erhalten.
Wasser 3.0 App
Die Wasser 3.0 App bündelt Wissen und Handeln für Wasser ohne Mikroplastik. Neben Wissenstransfer und Möglichkeiten des eigenständigen Recherchierens zum Thema Mikroplastik (Videos, Blogs, Quiz, Kurzbeschreibungen) bietet die App die Chance direkt beim Mikroplastik Mapping mitzumachen und bei der Kartierung der globalen Mikroplastik-Belastung mitzuhelfen.
Global Map of Microplastics - Spurensuche: Wo sind die Hotspots von Mikroplastik in der Umwelt?
Antworten hierauf gibt die Global Map of Microplastics. Auf einer interaktiven Karte kann man Wassertyp und Stärke der Mikroplastik-Belastung ablesen und selbst beim Mikroplastik Mapping aktiv werden. Die Global Map of Microplastics ist ein Beispiel, wie aktuelle Forschung im Bereich Mikroplastik-Analytik unmittelbar in Bildungsaktivitäten zu Wasser ohne Mikroplastik (WASoMI) integriert werden können.
Danksagungen
Diese Studie wurde vom Innovationsprogramm HORIZON EUROPE der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarungen 101093964 und 101112877 kofinanziert. Die Verantwortung für den Inhalt dieser Veröffentlichung trägt allein der Verfasser; die Europäische Kommission haftet nicht für die weitere Verwendung der darin enthaltenen Angaben. Darüber hinaus erhielt das Projekt von der Veolia-Stiftung (DEUTSCHLAND) | Projekt konti | detect zusätzlich finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken der abcr GmbH, Karlsruhe, Deutschland für die projektbezogene Kooperation.
Hinweis in eigener Sache
Alle Arbeiten im Bereich Global Map of Microplastics sind nur durch Spenden und Sponsoring möglich. Und davon braucht es mehr, um mehr Durchschlagskraft zu entwickeln. Werden Sie Teil der Lösung und Wirkungsbeschleuniger für Wasser ohne Mikroplastik.
Literaturverzeichnis
- S. Huang et al., "Detection and Analysis of Microplastics in Human Sputum", Environ Sci Technol, vol. 56, no. 4, pp. 2476-2486, Feb. 2022.
- M. T. Sturm, E. Myers, D. Schober, A. Korzin, and K. Schuhen, "Development of an Inexpensive and Comparable Microplastic Detection Method Using Fluorescent Staining with Novel Nile Red Derivatives," Analytica, vol. 4, no. 1, pp. 27-44, Mar. 2023.
- J. C. Prata, J. Padrao, M. T. Khan, and T. R. Walker, "Do's and don'ts of microplastic research: a comprehensive guide," Water Emerg Contam Nanoplastics 2024;3:8., vol. 3, no. 2, p. N/A-N/A, Mar. 2024.
- I. E. Napper and R. C. Thompson, "Plastics and the Environment," Annu Rev Environ Resour, vol. 48, no. Volume 48, 2023, pp. 55-79, Nov. 2023.
- B. Vilakati, V. Sivasankar, B. B. Mamba, K. Omine, and T. A. M. Msagati, "Characterization of plastic micro particles in the Atlantic Ocean seashore of Cape Town, South Africa and mass spectrometry analysis of pyrolyzate products," Environmental Pollution, vol. 265, p. 114859, Oct. 2020.
- M. T. Sturm, H. Horn, and K. Schuhen, "The potential of fluorescent dyes-comparative study of Nile red and three derivatives for the detection of microplastics," Anal Bioanal Chem, vol. 413, no. 4, pp. 1059-1071, Feb. 2021.
- M. T. Sturm, E. Myers, A. Korzin, S. Polierer, D. Schober, and K. Schuhen, "Fast Forward: Optimized Sample Preparation and Fluorescent Staining for Microplastic Detection," Microplastics 2023, Vol. 2, Pages 334-349, vol. 2, no. 4, pp. 334-349, Oct. 2023.
- A. Bogdanowicz, M. Zubrowska-Sudol, A. Krasinski, and M. Sudol, "Cross-contamination as a problem in collection and analysis of environmental samples containing microplastics-a review," Sustainability (Switzerland), vol. 13, no. 21, p. 12123, Nov. 2021.
- S. Adhikari, V. Kelkar, R. Kumar, and R. U. Halden, "Methods and challenges in the detection of microplastics and nanoplastics: a mini-review," Polym Int, vol. 71, no. 5, pp. 543-551, May 2022.