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28.09.2024

01.08.2024

Mikroplastik-Analytik: Der lange Weg zum Detektions-Standard - Identifikation von Fehlerquellen und die Chance der Fluoreszenz-Mikroskopie

Sophia Olbrich, Katrin Schuhen; et al , Wasser 3.0

Dennis Gövert, Hochschule Mannheim

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Mikroplastik wurde bereits an zahlreichen Orten in unserer Umwelt gefunden und das nicht nur in Gewässern, sondern auch in Luft und Boden. Über unterschiedliche Aufnahmewege, wie zum Beispiel die Nahrung, Wasser oder Atemluft, findet das Mikroplastik auch den Weg in den menschlichen Organismus [1].

Um Mikroplastikbelastungen einschätzen und Risiken besser bewerten zu können, ist es wichtig, Mikroplastik nicht nur "zu finden", sondern Mikroplastik-Belastung zu analysieren und die Auswirkungen von Mikroplastik zu erforschen.

Obwohl das Daten sammeln zu Mikroplastik-Belastungen kontinuierlich voranschreitet, fehlte es bisher an der Vereinheitlichung der Prozesse, sodass nicht nur Datenmassen, sondern auch nicht vergleichbare Daten entstehen. Hinzu kommt, dass die Mikroplastik-Detektion auf einem fehleranfälligen mehrstufigen Prozess aufbaut, der nicht erst mit dem analytischen Auswertungsgerät beginnt.

Es stellt sich demnach einmal mehr die Frage: Wie können wir Mikroplastik vergleichbar und kostengünstig detektieren?

Um diese Frage wissenschaftlich korrekt zu beantworten, ist es nötig, mehrere Prozessschritte einzeln und im Ganzen zu betrachten. Der Gesamtprozess lässt sich in vier Stufen unterteilen (Abbildung 1). Die Probennahme kann an den verschiedensten Standorten stattfinden, wobei im beschriebenen Anwendungsfall der Fokus auf Abwässer und Gewässer gelegt wird [2].

Gegenüberstellung MP-Analytik
Abb.1: Gegenüberstellung der aktuellen Variationsmöglichkeiten in der MP Analytik [3]

Bei der Probennahme wird üblicherweise das zu analysierende Wasser oder Abwasser durch Siebe oder Filter geleitet, um Partikel abzufangen. Die Maschenweite variiert hierbei je nach angewendeter Methode. Ohne standardisiertes Protokoll für die Probennahme, werden zwar Daten erhalten, die aber nicht verglichen werden können. [4]. Die Erfahrungen zeigen, dass je nach Belastung Probenvolumen von 100 L bis 10 m3 nötig sind. Stichproben mit geringem Probevolumen können als erster Anhaltspunkt für die Mikroplastikbelastung genutzt werden.

Fluoreszenzmarker
Abb.2: Fluoreszenzmarker (oben) und
angefärbtes Mikroplastik unter dem Fluor-
eszenzmikroskop (unten) (©Wasser 3.0)
Nach der Probennahme können die Proben auf verschiedenen Wegen aufbereitet werden. Hierbei werden natürliche Partikel entfernt, um die Partikelzahl zu reduzieren und die Mikroplastik Detektion zu erleichtern. Häufig wird auf einen Aufschluss der natürlichen Partikel durch Zugabe von Wasserstoffperoxid gesetzt, was dazu führt, dass natürliche Partikel gut abgebaut werden. Diese Aufbereitungsart erweist sich als schonende Methode für Mikroplastik [5]. Auch an dieser Stelle ist es notwendig, ein Standardprotokoll festzulegen, damit Vergleichsanalysen sinnhafte Ergebnisse liefern.

Nach der Probenaufarbeitung erfolgt die Detektion der Mikroplastik-Partikel. Als Detektionsmethode wurde in dieser Studie auf Fluoreszenz-Mikroskopie gesetzt. Als Fluoreszenzmarker wurde abcr eco Wasser 3.0 detect mix MP-1 (AB930015) verwendet.

Dieser Marker konnte in langjähriger Forschung entwickelt werden, um selektiv Mikroplastik anzufärben [2], [6], [7]. Gegenüber anderen Methoden zur Charakterisierung liegt der Vorteil von Fluoreszenzmikroskopie in der Schnelligkeit und Mess-Effizienz.

Aus dem Optimierungs- und Standardisierungsschritten ergibt sich ein Mehrschrittprotokoll bis zum Erhalt eines Ergebnisses (Abbildung 3).

Schritte MP-Analytik
Abb.3: Übersicht der einzelnen Schritte
der MP-Analytik (mit den Standardprotokollen
von Wasser 3.0) (eigene Darstellung)
Zu beachten ist, dass auch bei den Fluoreszenzmikroskopen Unterschiede existieren, die zu Abweichungen in der Analytik führen können. In der hier vorgestellten vergleichenden Versuchsreihe wurde neben einem vollautomatisierten Fluoreszenzmikroskop auch ein Lichtmikroskop eingesetzt, das für die entsprechenden Anforderungen kostengünstig zum Fluoreszenzmikroskop umgebaut werden kann [2].

Herausforderungen meistern, Fehlerquellen eliminieren!

Fehlerquellen und Herausforderungen sind nicht erst auf der Stufe der Detektion präsent (Abbildung 4). In jedem einzelnen Schritt von der Probennahme bis zur Detektion können Fehler passieren, die unmittelbaren Einfluss auf das Messergebnis haben. Gerade bei der Erarbeitung eines Detektionsstandards ist es wichtig, das Anforderungsprofil an die Mikroplastik-Analytik zu definieren und mehrere Methoden vergleichend zu prüfen. Methoden-übergreifende KI-gestützte Auswertungsmodelle können beim Datenmanagement helfen.

Übersicht Fehlerquellen MP-Analytik
Abb.4: Fehlerquellen und Herausforderungen
der Mikroplastik-Analytik [4], [8], [9]
Gerade in der Prozesskontrolle brauchen die Anlagenbetreiber Sicherheit und Kontrolle. Methoden und Verfahren, die Ergebnisse erst nach mehreren Wochen liefern sind für diesen Einsatz ungeeignet. Auch die kommunalen Kläranlagen brauchen Kontinuität und Messroutine. Zwei Messungen pro Jahr, wie es die EU-Kommunalabwasserrichtlinie für große Kläranlagen vorschreibt, geben keinen Hinweis auf reale Belastungen.

Schnelle, robuste, kostengünstige Verfahren werden dringend benötigt, um die Fehlerquellen verfahrens- und methodenseitig zu eliminieren. Dazu gehört auch, dass man Ergebnisse vermehrt hinterfragt und vergleichende Analysen anfordert. Mit der hier vorgestellten Studie erhöhen wir die Transparenz und teilen unser Wissen und neusten Erkenntnisse aus dem Bereich der Mikroplastik-Analytik.

Material und Methoden
Probennahme

Mobiler Partikel Sammler
Abb.5: Mobile Particle Sampling Unit
(PSU) von Wasser 3.0
Für die Probennahme wurden zwei verschiedene Methoden angewandt. Zum einen die standardisierte Methode mit der Particle Sampling Unit (Abbildung 5), welche durch ein großes (100 L bis 1 m³) Probevolumen eine repräsentative Probe liefert. Hierbei wurde Wasser durch eine 10 µm Filterkerze gepumpt, welche die im Wasser enthaltenen Partikel inklusive Mikroplastik zurückhält [2]. Partikel, die unterhalb der gewählten Grenze von 10 µm liegen, werden nicht zurückgehalten. Durch die Probennahme ergibt sich somit für die Gesamtmethode eine Detektionsgrenze für 10 µm Partikelgröße. Zum Transport ins Labor werden die Partikel in eine 2,5 L Glasflasche übertragen.

Ebenso wurden mittels einer 0,5 L-Probenahmeflasche eine direkte Stichprobe aus dem Gewässer entnommen, was eine einfach handhabbare und schnelle Methode darstellt. Bei jeder Probennahme wurden zwei Proben nacheinander genommen (P1 und P2).

Probenaufbereitung

Bei der Probenaufbereitung, bei welcher 500 mL Probe für die Detektion vorbereitet werden, wurde die Probe mit Wasserstoffperoxid behandelt, welches für den Aufschluss natürlicher Partikel sorgt und das Mikroplastik nicht oder nur geringfügig angreift. Um das Mikroplastik in der Probe anzufärben, wurden 25 µL des Fluoreszenzmarkers abcr eco Wasser 3.0 detect mix MP-1 hinzugegeben und die Probe über einen schwarzen Membranfilter filtriert [7]. Zur Untersuchung der Reproduzierbarkeit wurde jede Probe zweimal aufgearbeitet.

Detektion

Der Filter mit der angefärbten Probe wird zur Detektion unter einem Fluoreszenzmikroskop analysiert. Zum einen wurde hierbei ein Fluoreszenzmikroskop der Firma Zeiss (Axio Zoom.v16) genutzt, welches vollautomatisiert Fluoreszenzaufnahmen aufnehmen kann. Zusätzlich wurden Aufnahmen mit einem Lichtmikroskop der Firma Leica (DMS 300) angefertigt, welches für die Fluoreszenzmikroskopie modifiziert wurde und somit eine deutlich kostengünstigere Alternative bietet (Abbildung 6).

FLuoreszensmikroskope
Abb.6: Automatisiertes Fluoreszenz-Mikroskop (links). Für Fluoreszenzaufnahmen modifiziertes Mikroskop (Mitte, 1), welches mit einer LED-Taschenlampe an einem Greifarm (2) und einem Emissionsfilter (3) modifiziert wurde. Auch ist das Leica Mikroskop mit eingeschalteter LED-Taschenlampe, welche die Probe anstrahlt, zu sehen. Während der Aufnahmen wurde vor die Lampe ein blauer Bandpassfilter gehalten (4). (©Wasser 3.0)

Zur Modifikation des Leica Mikroskops wurde eine blaue LED-Taschenlampe als externe Lichtquelle auf die Probe gerichtet. Vor dem Objektiv des Mikroskops wurde ein grüner Emissionsfilter platziert, um das reflektierte Licht der Taschenlampe abzuhalten. Vor der Taschenlampe wurde als Anregungsfilter ein blauer Bandpassfilter gehalten. Bei beiden Mikroskopen erfolgt die Auszählung der Mikroplastikpartikel über eine automatisierte Partikeldetektionssoftware, welche zwischen hell leuchtendem Mikroplastik und nicht oder nur schwach leuchtenden sonstigen Partikeln unterscheiden kann.

Darstellung einzelner Quadrate
Abb.7: Darstellung der einzelnen Quadrate
auf dem gesamten Filter. (©Wasser 3.0)
Zur Analyse der MP Kontamination werden üblicherweise - statt der gesamten Filterfläche - einzelne Quadrate einer voreingestellten Größe fotografiert (Abbildung 7). Dadurch lässt sich zeitsparend mittels einer schnellen Messung von 2 bis 3 Minuten auf die Mikroplastikbelastung der gesamten Probe schließen [2]. Mit dem Zeiss Mikroskop war es zusätzlich möglich, Aufnahmen des gesamten Filters in einer höheren Auflösung anzufertigen. Diese Methode ermöglicht das Auszählen der Partikel auf dem gesamten Filter, nimmt aber eine größere Aufnahmezeit von 25 bis 30 Minuten pro Filter in Anspruch und ist nur mit vollautomatisierten Mikroskopen möglich.

Die Aufnahmen des gesamten Filters ermöglichen eine Gegenüberstellung mit den aufgenommenen Quadraten, sodass analysiert werden kann, wie repräsentativ diese die gesamte Filterfläche abbilden (Abbildung 7). Um das mit dem Zeiss Mikroskop aufgenommene Quadrat auch unter dem Leica Mikroskop zu finden, wurde es nach der Aufnahme farbig markiert, sodass mit diesem Mikroskop dasselbe Bild aufgenommen werden konnte und somit ein direkter Vergleich der detektierten Partikel möglich ist.

Ergebnisse und Diskussion
Kontaminationskontrolle

Zur Vermeidung von Mikroplastik-Einträgen aus der Umgebung (Luft, Kleidung, Gefäße, Labor) wurden ausschließlich Geräte aus Glas oder Metall genutzt und diese mit Aluminiumfolie abgedeckt. Gearbeitet wurde mit einem fusselarmen Schutzanzug, der vor Eintritt in das Labor mit einer Fusselrolle von Partikeln befreit wurde. Die Arbeitsflächen wurden zusätzlich mit einem fusselarmen Schwammtuch gereinigt und ein HEPA-Luftfilter sowie eine Luftschleuse eingesetzt. Ebenfalls wurden Blindproben zur Kontaminationskontrolle gemessen [5]. Hierzu wurden in Arbeitsumgebungen für eine Woche weiße Filter platziert, auf denen sich Staubpartikel und Kleidungsfasern absetzen können und anschließend unter dem Mikroskop ausgezählt werden konnten (Abbildung 8). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Aufnahmen und Auswertung
Abb.8: Mikroskop-Aufnahmen von weißen Rundfiltern nach einer Woche in einer Standard-Laborumgebung und der optimierten Laborumgebung (Mikroplastik Labor)(©Wasser 3.0)
Tab.1: Vergleich der gefunden Staubpartikel und Kleidungsfasern auf den 47 mm Rundfiltern aus drei verschiedenen Umgebungen.

Im Vergleich zur normalen Büro-Umgebung wurden im Labor 42 % weniger Partikel gefunden. In dem untersuchten Bereich werden Laborkittel getragen, ein HEPA-Luftfilter eingesetzt und auf sauberes Arbeiten geachtet. Im Mikroplastik-Labor, welches zusätzlich über eine Luftschleuse verfügt, konnten die Partikel im Vergleich zum Büro um fast 97 % und zum Standard-Labor um 94 % reduziert werden. Ebenfalls konnte hier die Anzahl an Fasern im Vergleich zum Standard-Labor um 93 % reduziert werden.

Standardisierte Probennahme

Sowohl die Probennahme mittels Probennahmeflasche als auch mit Hilfe der PSU stellen leicht handhabbare Methoden dar, die als standardisierte Verfahren angewendet werden können und vergleichbare Proben liefern. Hierbei ist bei der Probennahmeflasche anzumerken, dass es sich durch das vergleichbar kleine Probenvolumen um eine Stichprobe handelt.

Dies kann dazu führen, dass aufgrund der Inhomogenität des Mikroplastiks im Gewässer stärkere Abweichungen in der Mikroplastikbelastung auftreten können. Diese Methode eignet sich insbesondere dafür, an zahlreichen Ort ohne hohen Kosten- oder Zeitaufwand Proben zu nehmen und eine flächendeckende Analyse der Mikroplastikbelastung zu gewinnen (siehe hierzu Mikroplastik Mapping und die Wasser 3.0 App, die später erläutert werden).

Auch die PSU gewährleistet eine Probennahme an verschiedenen Standorten und bietet den Vorteil des größeren Probevolumens, ist jedoch im Vergleich zur Beprobung mit der Probennahmeflasche aufwändiger zu transportieren und aufzubauen.

Vergleich der Detektion mit zwei Fluoreszenzmikroskopen

Die Ergebnisse der verwendeten Mikroskope lassen sich direkt gegenüberstellen, da durch Markierung der einzelnen Quadrate jeweils dieselben Aufnahmen getätigt werden konnten (Abbildung 9). Die resultierenden Abweichungen sind in Tabelle 2 dargestellt.

Vergleich Aufnahmen beider Mikroskope
Abb.9: Vergleich der Auflicht- und Fluoreszenzaufnahmen der beiden Mikroskope. Auf der linken Seite sind die aufgenommenen Bilder eines Quadrates mit Lichtmikroskopie (oben) und Fluoreszenzmikroskopie (unten) mit dem Zeiss Mikroskop gezeigt. Während dieser Aufnahmen wurde das Quadrat farbig (grüner Punkt) markiert, was auf der anschließenden Aufnahme desselben Quadrates mit dem Leica Mikroskop (rechts) zu erkennen ist. (©Wasser 3.0)

Vergleich der Abweichung der Messung
Tab.2: Vergleich der Abweichung detektierten Partikel zwischen den Mikroskopen, Proben, Aufarbeitungen und Aufnahmen.

Beim direkten Vergleich der beiden verwendete Mikroskope anhand der zehn aufgenommenen identischen Quadrate ergab sich eine Abweichung von 46,6 % und eine Standardabweichung von 16,4 %. Hierbei spielt vor allem die Festlegung der korrekten Helligkeitsgrenzwerte für die Mikroplastikdetektion in der Partikeldetektionssoftware eine entscheidende Rolle. Diese wurde im Rahmen der Arbeiten anhand von Testaufnahmen verschiedener Mikroplastik- und natürlicher Partikel ermittelt. Um eine höhere Vergleichbarkeit zu gewährleisten, braucht es auch hier ein standardisiertes Verfahren, um Helligkeitswerte verschiedener Fluoreszenzmikroskop-Systeme direkt vergleichen zu können.

Inhomogene Verteilung des Mikroplastiks

Vergleicht man die erste und zweiten Aufbereitung derselben Probe, beträgt die Abweichung 43,7 ± 23,8 %. Dies ist auf die Herausforderung der Inhomogenität des Mikroplastiks in der Probe zurückzuführen. Selbst durch starkes Schütteln der Probe für 60 Sekunden vor Überführung in ein weiteres Gefäß kann nicht gewährleistet werden, dass die Partikel homogen verteilt sind und so gleichmäßig überführt werden.

Die Abweichung zwischen zwei mit der PSU direkt hintereinander genommenen Proben (P1 und P2) aus demselben Gewässer liegt bei 25,8 ± 17,5 %. Auch hier ist auf die Inhomogenität des Mikroplastiks zu verweisen, welche nicht nur innerhalb der Probe, sondern auch im Gewässer zu erkennen ist. Es ist anzumerken, dass die Abweichung zwischen den zwei Proben geringer ist als die Abweichung innerhalb derselben Probe.

Aufnahme gesamter Filter
Abb.10: Aufnahme des gesamten Filters
mittels Fluoreszenzmikroskopie (©Wasser 3.0)
Vergleicht man die Aufnahmen des gesamten Membranfilters, die das Auszählen der Partikel auf dem ganzen Filter ermöglicht, mit der Auszählung einzelner Quadrate, ist auch hier eine Abweichung zu erkennen. Vergleicht man fünf Quadrate mit dem ganzen Filter, ergibt sich eine Abweichung von 31,1 ± 18,8 %. Diese sinkt etwas ab, sobald die Anzahl an aufgenommenen Quadraten auf zehn erhöht wird und liegt dann bei 25,2 ± 18,3 %.

Nach der Filtration der Probe auf den schwarzen Membranfilter liegt das Mikroplastik nicht gleichmäßig verteilt vor (Abbildung 10), sodass es bei der Aufnahme des gesamten Filters im Vergleich zu einzelnen Quadraten zu den genannten Abweichungen kommt. So wurde zum Beispiel nach dem Auszählen von fünf Quadraten eine Belastung von 4,6 MP/L, bei zehn Quadraten von 6,5 MP/L und beim gesamten Filter 7,1 MP/L in einer ausgewählten Probe festgestellt.

Betrachtet man die beiden Methoden - das Aufnehmen einzelner Quadrate oder des gesamten Filters - hinsichtlich des Zeitaufwands, liegt der Vorteil bei der Auswertung der Quadrate. Während eine Aufnahme des gesamten Filters ungefähr 25 bis 30 Minuten in Anspruch nimmt, erhält man im anderen Fall die Ergebnisse in wenigen Minuten.

Durch die präsentierten Ergebnisse wird deutlich, dass die inhomogene Verteilung von Mikroplastik zahlreiche Herausforderungen in der Detektion bringt. Die Inhomogenität beeinflusst bereits die Probenahme und erschwert eine repräsentative Probenahme, besonders bei der Entnahme einer Stichprobe. Es wird daher empfohlen, mehrere Proben desselben Standortes zu analysieren, um ein repräsentativeres Ergebnis der Mikroplastikbelastung zu erhalten. Auch bei der Analyse der angefärbten Probe auf dem Filter mittels Fluoreszenzmikroskopie zeigt sich diese Problematik. Diese ist nur mit einem Kompromiss zu lösen, indem man zwischen analysierter Filterfläche und Genauigkeit der Ergebnisse sowie dem Zeitaufwand die beste Korrelation ermittelt.

Ein Weg entsteht, wenn man ihn geht...

Die Kontaminationskontrolle hat ergeben, dass die eingesetzten Methoden zur Verringerung von Partikeleinträgen über die Luft einen deutlichen Unterschied in der Anzahl an detektierten Partikeln und Fasern erbringen. Besonders Luftschleuse und Schutzanzüge konnten im Vergleich zum Standard-Labor eine deutliche Senkung der Fasern und Partikel hervorrufen.

Die von Wasser 3.0 entwickelten Standardverfahren zur Probennahme und -aufbereitung bieten die Möglichkeit von vergleichbaren Daten der Mikroplastikbelastung an verschiedensten Standorten. Mit der PSU steht eine Methode zur Entnahme einer repräsentativen Probenmenge zur Verfügung. Mittels Probennahmeflasche kann eine Stichprobe zur ersten Einschätzung der Kontamination entnommen werden.

Die Mikroplastik-Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie benötigt kein vollautomatisiertes Mikroskop. Fluoreszenzmikroskopie lässt sich auch kostengünstig durch Modifikation eines Licht-Mikroskops anwenden. Der Vorteil einer Automatisierung des Messprozesses liegt in der Messschnelligkeit und somit im höheren Probendurchsatz. Um die Vergleichbarkeit verschiedener Fluoreszenzmikroskope zu erhöhen, braucht es eine Methode zum Abgleich der Helligkeitswerte der Fluoreszenzsignale.

Bei der mehrfachen Detektion der Partikel einer Probe kam es zu Abweichungen. Selbst durch starkes Durchmischen der Probe vor der Entnahme einer Teilprobe lässt sich die inhomogene Verteilung des Mikroplastiks in der Probe nicht verhindern. Es ist ratsam mindestens mehrere Proben (mindestens zwei) zu analysieren, um verlässliche Daten zur Mikroplastikbelastung zu erhalten.

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Wasser 3.0 AppDie Wasser 3.0 App bündelt Wissen und Handeln für Wasser ohne Mikroplastik. Neben Wissenstransfer und Möglichkeiten des eigenständigen Recherchierens zum Thema Mikroplastik (Videos, Blogs, Quiz, Kurzbeschreibungen) bietet die App die Chance direkt beim Mikroplastik Mapping mitzumachen und bei der Kartierung der globalen Mikroplastik-Belastung mitzuhelfen.

Global Map of Microplastics - Spurensuche: Wo sind die Hotspots von Mikroplastik in der Umwelt?

Antworten hierauf gibt die Global Map of Microplastics. Auf einer interaktiven Karte kann man Wassertyp und Stärke der Mikroplastik-Belastung ablesen und selbst beim Mikroplastik Mapping aktiv werden. Die Global Map of Microplastics ist ein Beispiel, wie aktuelle Forschung im Bereich Mikroplastik-Analytik unmittelbar in Bildungsaktivitäten zu Wasser ohne Mikroplastik (WASoMI) integriert werden können.

Danksagungen

Diese Studie wurde vom Innovationsprogramm HORIZON EUROPE der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarungen 101093964 und 101112877 kofinanziert. Die Verantwortung für den Inhalt dieser Veröffentlichung trägt allein der Verfasser; die Europäische Kommission haftet nicht für die weitere Verwendung der darin enthaltenen Angaben. Darüber hinaus erhielt das Projekt von der Veolia-Stiftung (DEUTSCHLAND) | Projekt konti | detect zusätzlich finanzielle Unterstützung. Die Autoren danken der abcr GmbH, Karlsruhe, Deutschland für die projektbezogene Kooperation.

Hinweis in eigener Sache

Alle Arbeiten im Bereich Global Map of Microplastics sind nur durch Spenden und Sponsoring möglich. Und davon braucht es mehr, um mehr Durchschlagskraft zu entwickeln. Werden Sie Teil der Lösung und Wirkungsbeschleuniger für Wasser ohne Mikroplastik.

Literaturverzeichnis

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