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28.06.2022

19.05.2022

Xenofreie Entwicklung, Expansion und Differenzierung von humanen iPS-Zellen

Rick Cohen, Rutgers University

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Wir konnten in vorangegangenen Arbeiten zeigen, dass die Verwendung einer niedrigen Sauerstoffkonzentration die Effizienz einer Reprogrammierung humaner somatischer Zellen zur Pluripotenz steigert [1].

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ermöglichen eine Weiterentwicklung dieses Kultivierungs-Paradigmas. Wir konnten beobachten, dass Fibroblasten nach der Elektroporation bei 4 % O2-Gehalt auf synthetischen sowie biologischen Oberflachen wachsen.

Weiterhin beobachteten wir eine normale Ausbreitung von iPS-Zellkolonien mit einem hohen Reinheitsgrad in frühen Passagen. Die Zellen wurden erfolgreich in Motoneuronen sowie Kardiomyozyten-Lineages differenziert, was die Wirksamkeit des niedrigen Sauerstoffgehalts während der Zellkultivierung unterstreicht.

Einleitung

Die Reprogrammierung humaner somatischer Zellen in das pluripotente Stadium ist das Thema zahlreicher Publikationen seit ihrer Entdeckung im Jahr 2007. Die ersten Studien wurden mit einem Set von vier Genen durchgeführt, welche in nativen humanen embryonalen Stammzellen exprimiert werden: Oct4, Sox2, KLF4 und c-Myc (Lin28 und Nanog).

Diese Gene wurden mit Hilfe genetisch modifizierender Methoden, wie z.B. retrovirale Vektoren, in die Zellen eingeführt, gefolgt von Kultivierung auf undefinierten Wachstumssubstraten. In den 13 Jahren, die seit diesen zukunftsweisenden Studien vergangen sind, wurden zahlreiche Verbesserungen erzielt, wie z.B.

  1. der Ersatz genetisch modifizierender Methoden durch sicherere, das Genom nicht verändernde Alternativen;
  2. Substitution des c-Myc Oncogens durch das nicht transformierende Familienmitglied L-Myc;
  3. der Einsatz niedermolekularer Verbindungen zur Effizienzsteigerung der Reprogrammierung;
  4. Optimierung der Zellkulturbedingungen, einschließlich niedriger O2-Konzentration (4 - 5 %) und
  5. der Einsatz klinisch relevanter, definierter Medien und Wachstumssubstrate.
In dieser neuen Studie kombinierten wir zahlreiche dieser Verbesserungen, um die erfolgreiche Reprogrammierung von humanen Fibroblasten mit Hilfe niedriger O2-Konzentration im CO2-Inkubator CellXpert® C170i CO2 aufzuzeigen. Wir beobachteten, dass die untersuchten Wachstumssubstrate der reprogrammierten Fibroblasten eine stabile Zelladhäsion sowie -ausbreitung gewährleisteten. Dies führte wiederum zu einer robusten Produktion karyotypisch normaler iPSC-Kolonien mit der Fähigkeit, in einem definierten Medium robust zu expandieren sowie zu neuronalen und kardialen Lineages differenziert zu werden.


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