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16.10.2024
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Quantitative Proteomanalyse der Bindeproteine von Histon H3 und dem Four-and-a-Half-LIM 3 (FHL3) Protein

Klingberg, Rebecca - Freie Universität Berlin (2012)


Die Aufklärung spezifischer Protein-Protein-Interaktionen ist eine Grundvoraussetzung für das Verständnis vieler zellulärer Vorgänge. Durch massenspektrometrische Proteomanalysen wurde eine Vielzahl von posttranslationalen Proteinmodifikation, wie beispielsweise Phosphorylierungen, entdeckt, die Protein-Protein-Interaktionen regulieren können. Diese regulatorischen Proteinmodifikationen erschweren die Analyse der Protein-Protein-Interaktionen weiterhin, da sie in manchen Fällen Interaktionen erst ermöglichen, in anderen Fällen diese jedoch unterdrücken.

Ziel dieser Arbeit war es, mit den Mitteln der Chemischen Biologie und massenspektrometrischer Proteomanalysen die Protein-Protein-Wechselwirkungen von Histon H3 in Abhängigkeit von Phosphorylierung zu untersuchen sowie die Bindungspartner des Adapterproteins Four-and-a-Half-LIM 3 (FHL3) zu identifizieren.

Das erste Projekt dieser Arbeit widmete sich den phosphorylierungs-abhängigen Interaktionsproteinen von Histon H3. Histone verpacken DNA in Form von Chromatin und können Genregulation über posttranslationale Modifikationen steuern. Die Phosphorylierung von Serin-10 in Histon H3 ist eine dieser Modifikationen. In diesem Projekt sollten Proteine identifiziert werden, die vermittelt durch diese Modifikation an Histon H3 binden. Des Weiteren war geplant Bindeprotein von H3 zu identifizieren, die durch die Serin-10-Phosphorylierung von Histone H3 unterdrückt werden sowie die zugehörigen Phosphatasen, die diese Modifikation entfernen. Dazu wurde Phosphonomethylenalanin (Pma), ein Mimetikum von Phosphoserin, dass nicht durch Phosphatasen gespalten werden kann, an Position 10 in ein Peptid inkorporiert, das vom N-Terminus von H3 abgeleitet wurde. Nach Funktionsüberprüfung dieses Pma-modifizierten Peptids wurde eine Proteomanalyse basierend auf der SILAC-Methode (Stable isotope labeling by amino acids in cell culture) durchgeführt. Durch diese Analyse wurden diverse 14-3-3-Isoformen als Bindeproteine von Serin-10-phosphorylierten Histon H3 identifiziert. Phosphatasen konnten hingegen nicht gefunden werden.

Differenzielle SILAC-Analysen mit H3-Peptiden synthetisiert aus L- oder D-Aminosäuren erlaubten weiterhin die Identifikation vieler Proteine, die spezifisch an unmodifiziertes H3 binden. Darunter waren Komponenten eines Deacetylase-Komplexes (NuRD), Hitzeschockproteine (HSC70, APG2), transkriptionellen Aktivatoren (WDR5, MYST2) und Repressoren (EHMT2, KDM5B). Mit HAT1 und RBBP7 wurden ferner zwei Bindeproteine vom unmodifizierten H3 identifiziert, deren Bindung durch die Phosphorylierung von Serin-10 unterdrückt wurde. In nachfolgenden Validierungsexperimenten konnten diese Beobachtungen bestätigt werden. Für ausgewählte Proteine wurde des Weiteren die Beeinflussung des Bindungsvermögens in Abhängigkeit von allen bekannten Phosphorylierungen in H3-Tail untersucht.

In einem zweiten Projekt wurde das Four-and-a-Half-LIM 3 (FHL3) Protein einer quantitativen SILAC-Proteomanalyse unterzogen, mit dem Ziel, die bislang noch größtenteils unbekannten Interaktionspartner dieses Adapterproteins zu identifizieren und eine vermutete Interaktion mit Chromatinkomponenten experimentell zu überprüfen. Zunächst konnte gezeigt werden, dass FHL3 sowohl im Zellkern als auch im Cytosol, der für die Proteomanalyse verwendeten Fibroblastenzelline (Swiss 3T3) lokalisiert ist. Die nachfolgenden Proteomanalysen erlaubten die reproduzierbare Identifikation von 484 FHL3-Bindeproteinen in Zellkernextrakten und 244 in den cytosolischen Fraktionen dieser Zelllinie, wobei die meisten der identifizierten Protein bis jetzt nicht als Interaktionspartner von FHL3 beschrieben wurden. Eine direkte Interaktion mit Histonen konnte nicht beobachtet werden, wohl aber Proteine, die an Chromatinprozessierungen beteiligt sind. Ausgewählte FHL3-Interaktionspartner wurden durch Pull-Down Experimente und Western Blot Analyse bestätigt. Darunter befanden sich der transkriptionelle Coaktivator CBP, Schlüsselkomponenten der eukaryotischen DNA-Replikation (MCM3 und POLD1) und die mitotische Serin/Threonin-Kinase TLK1. Neben diesen kernlokalisierten Proteinen konnte die FHL3-Interaktion der Ubiquitin-Ligase DTX3L im nuklearen Extrakt und der cytosolischen Fraktion bestätigt werden sowie die FHL3-Bindung der cytosolischen Polyphosphoinositide-Phosphatase FIG4. Durch diese Proteomanalyse und die nachgeschalteten Validierungsexperimente konnte FHL3 mit einer Vielzahl essentieller sowie pathologischer zellulärer Prozesse in Verbindung gebracht werden.


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