Untersuchung zur biologischen Aktivität funktionalisierter Calciumphosphat-Nanopartikel
Klesing, Jan - Universität Duisburg-Essen (2012)
In dieser Arbeit wurden die Herstellung unterschiedlicher Calciumphosphat-Systeme auf nanopartikulärer Basis und deren Einsatz als Trägermaterial für Biomoleküle und Wirkstoffe diskutiert. Hierbei handelte es sich zum einen um kontinuierlich gefällte Calciumphosphat-Nanopartikel mit kugelförmiger Morphologie, zum anderen um das kommerziell erhältliche Knochenersatzmaterial Ostim® mit stäbchenförmiger Morphologie der Firma aap.
Im ersten Teil wurde eine kontinuierliche Fällung Carboxymethylcellulose-stabilisierter und DNA-beladener Calciumphosphat-Nanopartikel realisiert. Die eingestellten Mischungsverhältnisse zwischen dem Biopolymer Carboxymethylcellulose und der verwendeten Nukleinsäure wurden variiert und der adsorbierte DNA-Anteil elementaranalytisch quantifiziert. Weiterhin konnte die Langzeitlagerung durch den Einsatz unterschiedlicher Kryoprotektoren und anschließender Lyophilisation gezeigt werden. Vor dem Gesichtspunkt der Alterung kolloidaler Dispersionen im wässrigen Medium, gefolgt von der Agglomeration, ist dies ein entscheidender Schritt in die Richtung einer Anwendung in der pharmazeutischen Industrie. Die Übertragung der Resultate mit siRNA (anti-EGFP) an EGFP-exprimierenden HeLa-Zellen zeigte eine signifikante Herunterregulation der EGFP-Expression, was durch die Anwesenheit von Trehalose als Kryoprotektor gesteigert werden konnte.
Des Weiteren wurde die Darstellung von Polyethylenimin-stabilisierten Nanostäbchen basierend auf Ostim® realisiert. Die erhaltene kationische Dispersion konnte ebenfalls ohne Verlust des kolloidalen Charakters in Gegenwart von Trehalose lyophilisiert werden. Darüber hinaus wurden Transfektionsresultate mit EGFP-kodierender DNA an HeLa- und MG63-Zellen sowie Gen-Stummschaltungseffizienzen mit siRNA (anti-EGFP) an HeLa-EGFP-Zellen vor und nach der Lyophilisation für unterschiedliche Beladungen untersucht. Die erhaltenen Effizienzen waren mit denen kommerziell erhältlicher liposomaler Transfektionsreagenzien vergleichbar. Die Zellvitalität war jedoch signifikant höher, was auf die Biokompatibilität des hier vorgestellten Trägersystems zurückzuführen ist. Die Biokompatibilität ist essentiell für einen erfolgreichen Einsatz in der Gen-Therapie.
Weiter wurde der Einsatz von Calciumphosphat-Nanopartikeln als Trägersystem für den bereits zugelassenen Photowirkstoff mTHPC untersucht. Dazu wurden die Calciumphosphat-Nanopartikel mit Polyelektrolyten unterschiedlicher Ladung stabilisiert und der Photowirkstoff nachträglich in die Polymerschleifen eingebettet. Eine Umladung negativ geladener Partikel konnte mit Polyethylenimin realisiert werden. Die Stabilisierung der erhaltenen Dispersionen über einen längeren Zeitraum wurde mittels Lyophilisation in Gegenwart geeigneter Kryoprotektoren demonstriert. Die Phototoxizitätsstudien wurden in Kooperation mit der Firma biolitec in Jena an J774A.1-, HIG-82-, L929-, HT29- und Cal27-Zellen durchgeführt. Für die kationischen und mit mTHPC beladenen Partikelsysteme konnte nach erfolgter Lyophilisation in Gegenwart von Trehalose eine signifikante Reduktion der HT29- und Cal27-Zellen (Krebszelllinien) nach der Laserbehandlung beobachtet werden. Die Ergebnisse sind vielversprechend, ermöglichen dennoch keine direkte Adressierung in tumoröses Zielgewebe.
Um eine antibakterielle Wirksamkeit nachzuweisen, wurden der Gram-positive Bakterienstamm Staphylococcus aureus und der Gram-negative Bakterienstamm Pseudomonas aeruginosa untersucht. Für den Gram-positiven Bakterienstamm konnte eine vollständige Phototoxizität nach Bestrahlung erzielt werden. Der Gram-negative Bakterienstamm war wesentlich resistenter. Im Großen und Ganzen ist eine signifikante photodynamische Wirksamkeit der hier vorgestellten Träger gegenüber Krebszellen und Bakterien zu verzeichnen. Zusätzlich ist der Einsatz des hydrophoben Farbstoffes mTHPC durch dessen Einlagerung in die stabilisierenden Polymerschichten der Calciumphosphat-Nanopartikel in Wasser realisiert worden.
Im letzten Kapitel wurde erstmals die Darstellung Chondroitin-4-sulfat-funktionalisierter Calciumphosphat-Nanopartikel durch einen kontinuierlichen Fällungsprozess beschrieben. Das eingesetzte Polymer Chondroitin-4-sulfat ist als Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix biokompatibel und verfügt aus biomedizinischer Sicht über viele regulierende Eigenschaften. Die erhaltenen Partikel wurden mittels kolloid-chemischer Methoden vollständig charakterisiert. Die Zusammensetzung der erhaltenen Partikel wurde elementaranalytisch und thermogravimetrisch bestimmt. Ein Einsatz dieser Nanopartikel als Implantatbeschichtung oder zur Auffüllung und Rekonstruktion von Knochendefekten ist somit durchaus denkbar.