Analytik NEWS
Das Online-Labormagazin
15.10.2024
Glossar durchsuchen

Linksammlung durchsuchen

Chemische und molekularbiologische Studien am Psymberin-Gencluster

Frank, Sarah - Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn (2014)


Polyketide sind Naturstoffe und werden in Organismen von Polyketidsynthasen (PKS) gebildet. Der Mechanismus der Kettenverlängerung bei der Polyketidbildung ist eine Claisen-artige Kondensation von Acylbausteinen, durch die diese in die wachsende Polyketidkette eingebaut werden. Katalysiert wird diese Reaktion von Ketosynthasedomänen (KS), wobei die Bausteine von Acyltransferasen (AT) selektiert werden. In den letzten Jahren wurde die neue Gruppe der trans-AT-PKS entdeckt, bei denen das Kolinearitätsprinzip oft nicht zutrifft. Bei dieser Art der PKS sind die AT- anders im Gegensatz zu herkömmlichen PKS nicht in Multidomänenenzyme integriert sondern agieren in trans zu selbigen. Eine phylogenetische Analyse zeigte, dass die Gensequenzen der KS in trans-AT-PKS mit den Teilstrukturen der jeweiligen Substrate korrelieren. Da die Korrelation von Substratstruktur und KS-Sequenz nur auf in silico-Daten beruhte, sollte in der vorliegenden Arbeit die Substratspezifität mittels in vitro-Experimenten untersucht werden. Hierzu wurden die ersten drei Psymberin-KS-Domänen (KS1, KS2, KS3) inE. coli überproduziert und Testsubstrate synthetisiert. Die in vitro-Assays wurden von Matthew Jenner aus dem Arbeitskreis Oldham an der Universität Nottingham (UK) durchgeführt. Hierbei wurden die KS-Domänen mit den Substraten inkubiert und massenspektrometrisch untersucht. Die KS1 sowie KS2 aus dem Psymberin-Gencluster erwiesen sich als relativ unselektiv bei Umsetzungen mit den Thioesterderivaten. Die kohlenstoffverzweigten Intermediate waren jedoch nicht in der Lage, KS3 sowie KS5 aus dem Bacillaen-Gencluster zu acylieren. Hier zeigte sich eine deutliche Bevorzugung der unverzweigten Testsubstrate. Die vorhergesagte Substratspezifität von KS in trans-AT-Systemen wurde zum ersten Mal durchin vitro-Daten gestützt.

Es wurde gezeigt, dass die Spezifität bis zur β-Position stark ausgeprägt und für die einzelnen KS unterschiedlich ist. Diese Erkenntnis ist sowohl für die Analyse weiterer trans-AT-Gencluster als auch für die kombinatorische Biosynthese von Nutzen. In einem zweiten Projekt wurden Testsubstrate zur in vitro-Untersuchung der Proteine PsyD, PsyC sowie PsyK aus dem Psymberin-Gencluster synthetisiert und in Proteinassays getestet. Hierdurch sollte die Funktion der Enzyme untersucht werden.Im ersten Modul von PsyD ist eine putative O-Methyltransferasedomäne (O-MT) integriert. Eine weitere Besonderheit stellen die α-Hydroxylasen PsyC und PsyK dar. Die Assays mit den synthetisierten Testsubstraten zeigten jedoch trotz Variation der Bedingungen keine Umsetzung. In einem weiteren Teilprojekt wurden Testsubstrate zur näheren Untersuchung der Pederin trans-AT-PKS synthetisiert. Im Pederin-Gencluster befindet sich eine Pyransynthasedomäne (PS), die putativ für einen Ringschluss innerhalb der wachsenden Kette während des Biosyntheseweges verantwortlich ist. Um dies zu testen, wurden von Petra Pöplau aus dem Arbeitskreis Piel mit einem Testsubstrat sowie Teststandard PS-Assays durchgeführt und diese per HPLC vermessen. Es wurde hierbei gezeigt, dass diese Domäne des Pederin-Genclusters tatsächlich für den Ringschluss verantwortlich ist. Sie katalysiert eine intramolekulare Oxakonjugat-Addition der Hydroxyfunktion an die Doppelbindung innerhalb des Substrats.


» Volltext