Neue Markierungsmethode liefert umfassenden Einblick in zelluläre Prozesse

Eine internationale Forschungsgruppe unter der Leitung der Universitätsmedizin Göttingen (UMG) hat eine Markierungsmethode entwickelt, bei der die fluoreszierenden Marker nicht anhand ihrer Farbe, sondern anhand ihrer Leuchtdauer unterschieden werden.

Dadurch lassen sich mit Standardmikroskopen acht verschiedene Proteine in einer Zelle gleichzeitig in einem einzigen Schritt sichtbar machen. Die Ergebnisse wurden in der Fachzeitschrift "ACS Nano" der American Chemical Society veröffentlicht.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine wichtige Methode in der biomedizinischen Forschung, die eine spezifische Darstellung von Proteinen und zellulären Strukturen ermöglicht. Dazu werden in der Regel Antikörper verwendet, da diese Zielproteine gezielt erkennen und sich mit fluoreszierenden Farbstoffen koppeln lassen.

Die Farbstoffe werden anschließend angeregt und beginnen zu leuchten beziehungsweise zu fluoreszieren, wobei das emittierte Licht von einem Mikroskop erfasst und das Zielprotein somit sichtbar gemacht werden kann. Das Problem: Herkömmliche Mikroskope können jeweils nur drei bis vier Farben gleichzeitig erfassen - zum Beispiel Blau/Violett, Grün, Gelb/Orange und Rot -, sodass in der Praxis auch nur so viele Proteine gleichzeitig unterschieden werden können.

Ein internationales Forschungsteam unter der Leitung von Prof. Dr. Felipe Opazo, Forschungsgruppenleiter am Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie sowie am Center for Biostructural Imaging of Neurodegeneration (BIN) der Universitätsmedizin Göttingen (UMG), hat nun gemeinsam mit Dr. Roman Tsukanov, Postdoktorand am Dritten Institut für Physik der Universität Göttingen, eine zweite Dimension dafür erschlossen. Neben der Farbe nutzen die Forschenden eine Eigenschaft, die bisher kaum genutzt wurde: die Fluoreszenzlebensdauer, also die wenigen Milliardstel Sekunden, die ein Farbstoff nach der Anregung durch Laserlicht nachleuchtet.

"Zwei Marker können farblich identisch aussehen und dennoch klar voneinander getrennt werden, da der eine messbar länger fluoresziert als der andere. Das ist ein bisschen so, als würde man zwei Instrumente nicht anhand der Tonhöhe unterscheiden, sondern danach, wie schnell der Klang abklingt", erklärt Prof. Opazo, der die Studie konzipiert und geleitet hat. "Für uns war es wichtig, dass sich die Methode problemlos mit herkömmlichen Lichtmikroskopen umsetzen lässt, die in der Lage sind, die Fluoreszenzlebensdauer zu detektieren. Es ist keine spezielle Mikroskopieplattform erforderlich", ergänzt Dr. Tsukanov, ebenfalls Letztautor der Studie.

Eine Proteintasche gibt die Leuchtdauer vor

Der Clou liegt in der Umgebung der fluoreszierenden Farbstoffe. Wie lange ein Farbstoff leuchtet, hängt von seiner unmittelbaren chemischen Umgebung ab. Im Gegensatz zu anderen Methoden befinden sich die Farbstoffe hier in einer Proteintasche, die in vier genetisch veränderten Varianten vorliegt. Jede dieser vier Taschen verleiht einem bestimmten Farbstoffmolekül eine spezifische Fluoreszenzlebensdauer. Somit lassen sich bei Verwendung eines einzigen rot fluoreszierenden Farbstoffs theoretisch vier verschiedene Zielproteine gleichzeitig nachweisen, indem die unterschiedlichen Fluoreszenzlebensdauern genutzt werden, die jede Taschenvariante erzeugen kann - andernfalls würden sie in der Farbdimension alle rot erscheinen.

Die Proteintasche lässt sich leicht an Nanokörper koppeln. Nanokörper sind aus Alpakas gewonnenen Miniatur-Antikörper, die etwa ein Zehntel so groß wie ein herkömmlicher Antikörper sind. Da es bereits viele herkömmliche Antikörper gibt, die verschiedenste Zielproteine erkennen, werden diese genutzt, um im ersten Schritt an das gesuchte Zielprotein zu binden. An diese Antikörper binden wiederum die Nanokörper mit den Proteintaschen.

Der darin befindliche Farbstoff wird anschließend angeregt und macht das Zielprotein unter dem Mikroskop sichtbar. Auf diese Weise können die Nanokörper den "Code" der Fluoreszenzlebensdauer auf jeden herkömmlichen Antikörper übertragen, den ein Labor routinemäßig verwendet. Der praktische Nutzen ist beträchtlich. Im Gegensatz zu anderen herkömmlichen Methoden werden die Antikörper bereits vor der Färbung mit den Nanokörpern vorkonjugiert, was die Markierung aller Zielmoleküle in einem einzigen Schritt ermöglicht.

Für die Studie hat das Team 26 Farbstoffe in den vier "Proteintaschen"-Varianten systematisch gemessen und die Ergebnisse in einer Art Katalog zusammengefasst, aus dem sich gezielt geeignete Kombinationen auswählen lassen. Die Forschenden bezeichnen die Methode "Nanobody-guided Fluorescence Lifetime Multiplexing", kurz "NanoFLex".

Perspektiven für Gewebeuntersuchungen und Biopsien

Der Ansatz könnte sich insbesondere für klinische Proben als nützlich erweisen. Menschliches Gewebe weist eine natürliche Hintergrundleuchtkraft auf, die viele Färbungen stört. Diese Autofluoreszenz-Lebensdauer lässt sich jedoch leicht von den eigentlichen Signalen trennen. Zusammen mit der Möglichkeit, viele Marker aus einem einzigen Schnitt oder einer einzigen Probe auszulesen, macht dies die Methode attraktiv für die Analyse von Biopsien, bei denen das Material knapp und wertvoll ist. Die Autoren gehen davon aus, dass die Anzahl der gleichzeitig nachweisbaren Proteine weiter steigen wird, sobald neue Farbstoffe und verbesserte computergestützte Analysemethoden zur Verfügung stehen.

Fördergeber

Die Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Sonderforschungsbereiche SFB 1286, SFB TRR 274 und SFB 1690, durch den Exzellenzcluster "Multiscale Bioimaging: Von molekularen Maschinen zu Netzwerken erregbarer Zellen" (MBExC), vom Europäischen Forschungsrat (ERC) sowie vom Forschungs- und Innovationsprogramm "Horizont 2020" der Europäischen Union gefördert.

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Quelle: Universitätsmedizin Göttingen