01.10.2026

Native Membranproteine in kürzester Zeit automatisiert aufreinigen

Stefano Manduzio , Brian Seitz, Analytik Jena GmbH+Co. KG

Trotz ihres Potenzials als Wirkstofftargets stellen Membranproteine nach wie vor eine große Herausforderung für die Forschung dar. Ihre Aufreinigung ist traditionell mit aufwendigen, zeitintensiven und fehleranfälligen manuellen Arbeitsschritten verbunden, was häufig zu geringen Erfolgsraten führt.

Jede Aufreinigung kann mehrere Tage in Anspruch nehmen und muss häufig bei niedrigen Temperaturen durchgeführt werden. Darüber hinaus führt der Einsatz von Lösungsmitteln zur Solubilisierung der Proteine häufig zu deren Denaturierung.

Da die Funktion von Proteinen sowie ihre Interaktion mit Wirkstoffen und anderen Molekülen von ihrer dreidimensionalen Struktur abhängen, muss ihre native Konformation anschließend durch zusätzliche, oft komplexe und ineffiziente Verfahren wiederhergestellt werden.

Die Ergebnisse struktureller und funktioneller Analysen sind daher häufig nur eingeschränkt aussagekräftig und bilden die biologischen Gegebenheiten nicht ausreichend ab. Um diese Herausforderungen zu adressieren, haben Analytik Jena und Cube Biotech eine schnelle, effiziente und benutzerfreundliche Lösung für die Membranproteinaufreinigung entwickelt.

Der CyBio FeliX ist ein Liquid Handler, der als präzise Pipettierplattform zahlreiche Anwendungen auf kleinem Raum ermöglicht. Die NativeMP™-Technologie bildet Copolymer-Nanodiscs um Membranproteine und erhält so deren natürliche Lipidumgebung während des Aufreinigungsprozesses. Dadurch können Membranproteine aus unterschiedlichen Zelltypen bei Raumtemperatur und lösungsmittelfrei in ihrer nativen dreidimensionalen Struktur solubilisiert werden.

Für die Automatisierung des PlateX MP™-Protokolls auf dem CyBio FeliX muss der Anwender lediglich die Zellproben bereitstellen. Alle weiteren Schritte erfolgen automatisiert. Innerhalb von weniger als drei Stunden stehen hochreine Proteine in ihrer nativen 3D-Struktur für die Lagerung oder weiterführende Analysen bereit.

Der gesamte Prozess ist reproduzierbar und standardisiert und liefert mit wenig Aufwand konsistente Ergebnisse. Das in dieser Applikationsschrift beschriebene Protokoll wurde für das Screening von bis zu acht verschiedenen Copolymeren optimiert und kann bei Bedarf skaliert werden. Die vorgestellte Lösung verdeutlicht das Potenzial der Methode als einfach anzuwendende und lösungsmittelfreie Methode zur Aufreinigung von Membranproteinen.

Entscheidend ist jedoch vor allem, dass die Automatisierung die Aufreinigung von Membranproteinen von einer anspruchsvollen Spezialaufgabe zu einem zuverlässigen Routineprozess macht. Dadurch können sich Forschende auf die Analyse hochwertiger Proben konzentrieren und reproduzierbare Ergebnisse erzielen.

Material und Methoden

Tab.1: Mittels CyBio FeliX automatisiert aufgereinigte
Proteine mit den jeweiligen Tags und Proteinklassen.

Acht verschiedene Proteine, die in Tabelle 1 aufgeführt sind, wurden von Cube Biotech in humanen Zellkulturen gemäß den in Hanisch et al., 2025 beschriebenen Protokollen exprimiert [1].

Die aufgereinigten Proteine wurden anschließend hinsichtlich ihrer Konzentration, Aggregation und thermischen Stabilität charakterisiert. Darüber hinaus wurde das Protein P2X4 von Cube Biotech für die Bestimmung seiner dreidimensionalen Struktur mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) verwendet.

Bewertung der Aufreinigungsleistung

Sieben weitere GPCR-Proteine (nicht in Tabelle 1 aufgeführt) wurden bei Orogen Therapeutics mit dem automatisierten CyBio-FeliX-Protokoll, dem manuellen NativeMP™-Protokoll auf Copolymerbasis sowie mit konventionellen lösungsmittelbasierten Verfahren aufgereinigt.

Die aufgereinigten Proteine wurden anschließend mittels Western Blot analysiert. Dabei wurden die Ausbeute (µg pro g Zellkultur), die Bandengröße sowie das Vorhandensein ko-aufgereinigter Moleküle zwischen den verschiedenen Aufreinigungsmethoden und Copolymer-Chemien verglichen.

PlateX MP^TM

Abb.1: PlateX MP^TM Plattenlayout mit
acht verschiedenen Copolymeren.

PlateX MP^TM wurde von Cube Biotech als gebrauchsfertiges System mit lyophilisierten Reagenzien in einem spaltenbasierten Plattenlayout bereitgestellt (Abbildung 1). Jede Vertiefung der ersten Spalte enthält ein unterschiedliches Copolymer, um das für die Isolierung de s jeweiligen Zielproteins am besten geeignete Copolymer zu identifizieren. Die zweite Spalte bleibt für die Zugabe des Zell-Lysats frei. Die zwölfte Spalte ist für die finale Elution der aufgereinigten Proteine vorgesehen.

Die Platten werden mit drei verschiedenen magnetischen Bead-Typen bereitgestellt, die eine spezifische Bindung der jeweiligen Affinitäts-Tags ermöglichen: MagStrepreg; Strep-Tactinreg;XT, Rho1D4 oder Anti-DYKDDDDK/FLAG.

Methode

Das vollständige PlateX MP^TM-Protokoll ist über Cube Biotech erhältlich. Die automatisierte Methode wurde validiert (siehe Abschnitt Ergebnisse und Diskussion) und ermöglicht einen vollständig automatisierten Walk-away-Betrieb.

Das System ist als Plug-and-Play-Lösung ausgelegt. Benutzereingriffe sind lediglich für die initiale Bestückung des CyBio-FeliX-Decks sowie für die Zugabe des Zell-Lysats zu PlateX MP™ erforderlich.
Kurz zusammengefasst umfasst das Protokoll folgende Schritte:

1. Herstellung des Zell-Lysats außerhalb des Systems
   
2. Resuspendierung der lyophilisierten Äquilibrierungs- und Waschpuffer
   
3. Resuspendierung des Elutionspuffers
   
4. Zweistufiges Mischen von Cubipols und Zell-Lysat
   
5. Drei Zyklen zur Äquilibrierung der magnetischen Beads
   
6. Bindung der Zielproteine durch Mischen von Copolymer-Zell-Lysat-Gemisch und magnetischen Beads
   
7. Vier Waschzyklen der magnetischen Beads
   
8. Zwei Elutionszyklen zur Freisetzung der aufgereinigten Proteine
   
9. Transfer der eluierten Proteine in 1,5-mL-Reaktionsgefäße

Mit Ausnahme der Herstellung des Zell-Lysats wurden alle Prozessschritte vollständig automatisiert: Die Methodenerstellung erfolgte mithilfe der Skriptsoftware CyBio Composer von Analytik Jena. Das Protokoll kann nun über die Software Analytik Jena AppStudio vollständig automatisiert ausgeführt werden.

PlateX MP^TM ist für die spaltenweise Verarbeitung ausgelegt. Daher wurde das Protokoll mit dem CyBio FeliX CHOICE Pipettierkopf in Kombination mit dem 8-Kanal-CHOICE-Adapter durchgeführt. Das Skript steht jedoch auch für Anwender des CyBio FeliX R96 / 1000-µL-Pipettierkopfs zur Verfügung. Abbildung 2A zeigt das Decklayout des CyBio FeliX für dieses Protokoll. Abbildung 2B stellt die einzelnen Prozessschritte grafisch dar. Für die Durchführung des gesamten Protokolls wird lediglich eine 96er-Tipbox benötigt.

Abb.2: (A) Decklayout des CyBio FeliX. (B) Schematische Darstellung des Workflows: Die Zyklen aus Tipaufnahme, spaltenweisem Reagenztransfer, Mischen und magnetischer Separa-tion der Beads werden vollständig vom CyBio FeliX durchgeführt. (Dargestellt ist nur ein Teil der Deckmodule.)

Die Proteinaufreinigung erfolgt dabei in wiederkehrenden Zyklen aus:

1. Aufnahme einer Tipsäule
   
2. Transfer der Reagenzien zwischen den Spalten der PlateX MP™-Platte
   
3. Intensives Mischen auf dem BioShake 3000-T elm sowie durch Pipettieren
   
4. Magnetische Separation der Beads

Ergebnisse und Diskussion

Wissenschaftler von Orogen Therapeutics verglichen das automatisierte Verfahren mit manuellen Protokollen, sowohl auf Basis klassischer Detergenzien als auch der NativeMP^TM-Technologie. Während alle untersuchten manuellen Verfahren einen Arbeitsaufwand von drei bis vier Tagen erforderten, konnte das in dieser Applikationsschrift vorgestellte automatisierte Protokoll in weniger als drei Stunden durchgeführt werden. Im Gegensatz zu den mehrtägigen, lösungsmittelbasierten Methoden ermöglicht dies einen echten Walk-Away-Workflow. Darüber hinaus wurde der Verbrauch an Pipettenspitzen auf eine einzige 96er-Tipbox optimiert, wodurch die Kosten für Verbrauchsmaterialien reduziert werden.

Weiterhin wurden sieben verschiedene GPCR-Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten aus Insektenzellen exprimiert und gereinigt. Wie in Tabelle 2 und 3 dargestellt, war die mit dem automatisierten CyBio-FeliX-Protokoll erzielte Proteinausbeute (µg pro g Zellmasse) im Vergleich zu beiden manuellen Verfahren um den Faktor 2 bis 38 höher. Eine höhere Proteinausbeute bedeutet kleinere Zellkulturansätze, geringere Materialkosten, einen reduzierten Arbeitsaufwand sowie mehr Probenmaterial für nachgelagerte Analysen und Anwendungen.

Tab.2 (links): Leistungsdaten der manuellen detergenzbasierten, manuellen copolymerbasierten und automatisierten copolymerbasierten Aufreinigung von sieben GPCR-Proteinen mit dem CyBio FeliX. Für jedes Protein (1 bis 7) sind das Molekulargewicht (MW [kDa]), die eingesetzte Menge an Insektenzellkultur [g] sowie die erzielte Ausbeute [µg] der manuellen detergenzbasierten Aufreinigung (Yield db), der manuellen copolymer-basierten Aufreinigung (Yield cb) und des automatisierten CyBio-FeliX-Protokolls aufgeführt.
Tab.3 (rechts): Zusätzlich ist für jedes Protein die Ausbeute an aufgereinigtem Protein pro Gramm Insektenzellen [µg/g] dargestellt. Der Ver-gleich der manuellen und automatisierten Verfahren zeigt die durch die Automatisie-rung auf dem CyBio FeliX erzielte Steigerung der Proteinausbeute.

Zu diesem Ergebnis haben zwei Faktoren beigetragen:

1. Die modernen Copolymere von Cube Biotech bieten im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren eine verbesserte chemische Grundlage für die Aufreinigung von Membranproteinen.
   
2. Die Automatisierung auf dem CyBio FeliX gewährleistet eine effiziente und reproduzierbare Durchmischung der Zellproben mit Copolymeren und magnetischen Beads. Durch das gleichmäßige und verlängerte Mischen werden die Wechselwirkungen zwischen Zielprotein, Copolymer und Beads maximiert und somit die Ausbeute der isolierten Proteine erhöht. Ein vergleichbarer Effekt lässt sich durch manuelles Vortexen oder Schütteln von Reaktionsgefäßen nicht erreichen, ohne einen erheblichen zusätzlichen Arbeitsaufwand zu verursachen.

Orogen Therapeutics analysierte die aufgereinigten Proteine zusätzlich mittels Western Blot, um die Leistungsfähigkeit der verschiedenen Aufreinigungsmethoden zu bewerten. In dieser Applikationsschrift werden ausgewählte Ergebnisse vorgestellt; die vollständigen Datensätze können bei Cube Biotech angefordert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass mit der vorgestellten Methode je nach eingesetzter Copolymer-Chemie verschiedene Copolymere dasselbe Zielprotein effizient und frei von unerwünschten Begleitmolekülen isolieren können. Insgesamt sind die erzielten Resultate mit denen einer herkömmlichen manuellen detergenzbasierten Aufreinigung vergleichbar oder diesen sogar überlegen (Abbildung 3 links).

Auch beim Vergleich der manuellen und automatisierten copolymerbasierten Aufreinigung wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt (Abbildung 3 rechts). Die Größe der mit den Copolymeren von Cube Biotech aufgereinigten Proteine wird weder durch den verwendeten Protein-Tag noch durch die Nanodisc beeinflusst. Obwohl die Proteine während der Aufreinigung an die jeweiligen Tags gebunden sind, sind diese von geringer Größe und haben keinen Einfluss auf die Funktionalität des Zielproteins.

Abb.3: Ergebnisse der Western-Blot-Analyse von Proteinen, mittels manueller Verfahren bzw. mithilfe der CyBio-FeliX-Automatisierung aufgereinigt.
links: Protein 1 (58 kDa, GPCR), aufgereinigt mit zweistufigen detergenzbasierten Verfahren bzw. copolymerbasierten CyBio-FeliX-Protokoll.
rechts: Protein 4 (101 kDa, GPCR), aufgereinigt mit manuellen copolymerbasierten Verfahren bzw. copolymerbasierten CyBio-FeliX-Protokoll.

Die Konzentration, Aggregation und thermische Stabilität aller acht mit dem copolymerbasierten CyBio FeliX-Verfahren aufgereinigten Proteine (siehe Tabelle 1) wurden von Cube Biotech untersucht. Im Folgenden werden exemplarisch die Ergebnisse für P2X4 (Abbildung 4) dargestellt, das zudem für die dreidimensionale Strukturbestimmung mittels Cryo-EM verwendet wurde (Abbildung 5). Die Konzentration des mit den verschiedenen Copolymeren aufgereinigten Proteins wurde anhand der intrinsischen Fluoreszenz bei 330 nm bestimmt und mit einer unter identischen Bedingungen erstellten BSA-Standardkurve verglichen (Abbildung 4 links oben). Die Ergebnisse zeigen, dass mit allen getesteten Copolymeren hochreine Proteine in hoher Konzentration gewonnen werden können und somit für weiterführende Analysen geeignet sind.

Zur Untersuchung der Proteinaggregation wurde die Dynamische Lichtstreuung (Dynamic Light Scattering, DLS) eingesetzt. Für alle analysierten Proteine zeigten Polydispersitätsindex und Größenverteilung eine homogene Proteinpopulation mit geringer Aggregation, die in ihrer nativen Lipidumgebung stabilisiert war (Abbildung 4 links unten).

Die thermische Stabilität der aufgereinigten Proteine wurde mittels nanoDSF bestimmt. Wie die Ergebnisse in Abbildung 4 rechts zeigen, können die physikochemischen Eigenschaften der aufgereinigten Proteine abhängig von der eingesetzten Copolymer-Chemie deutlich variieren.

Abb.4: Analyse der Konzentration, Aggregation und thermischen Stabilität von gereinigtem P2X4.
Links oben: Analyse der intrinsischen Fluoreszenz; links unten: Dynamische Lichtstreuung (DLS); rechts: NanoDSF.

Direkt nach der Aufreinigung wurde die Eignung von P2X4 für Cryo-EM anhand seiner bevorzugten Partikelorientierung bewertet. Wie bereits in anderen Untersuchungen gezeigt wurde, kann die eingesetzte Copolymer-Chemie die bevorzugte Orientierung der Proteinpartikel beeinflussen. Im vorliegenden Fall zeigte das mit dem Cubipol Glycerol-Copolymer aufgereinigte P2X4 eine ausgewogene Winkelverteilung der Partikel, wodurch eine dreidimensionale Rekonstruktion des Proteins ermöglicht wurde (Abbildung 5).

Abb. 5: Analyse der Eignung von P2X4 für die Kryo-EM und Bestimmung der dreidimensionalen Struktur. (A) Kryo-EM-Aufnahmen von sechs verschiedenen P2X4-Copolymer-Kombinationen, die die vom Copolymer abhängigen Unterschiede bei den Partikeln veranschaulichen.
(B) Repräsentative 2D-Klassenmittelwerte aus Datensätzen die mit Sulfo-Cubipol Medium and Cubipol Glycerol gewonnen wurden.
(C) Dreidimensionale Rekonstruktion der mit Cubipol-Glycerin stabilisierten P2X4-Probe. Das zusammen mit P2X4 mitgereinigte endogene ATP ist deutlich zu erkennen (magenta hervorgehoben).

Zusammenfassung

Abb.6: CyBio FeliX Grundeinheit mit CHOICE Head

Herkömmliche lösungsmittelbasierte Verfahren zur Aufreinigung von Membranproteinen erschweren Forschung und Entwicklung durch komplexe Arbeitsabläufe, anspruchsvolle Versuchsbedingungen, eingeschränkte Reproduzierbarkeit und geringe Erfolgsraten. Die Automatisierung der NativeMP^TM-Copolymere und des PlateX MP^TM-Protokolls von Cube Biotech auf dem CyBio FeliX eröffnet neue Möglichkeiten für die Untersuchung von Membranproteinen und macht deren Aufreinigung schneller, reproduzierbarer und effizienter.

Der automatisierte Workflow ermöglicht einen vollständigen Walk-Away-Betrieb und reduziert die Prozessdauer von mehreren Tagen auf wenige Stunden. Durch den Verzicht auf Detergenzien erlaubt die NativeMP^TM-Technologie die Aufreinigung stabiler Proteine in ihrer nativen dreidimensionalen Struktur. Im Vergleich zu lösungsmittelbasierten Verfahren entstehen dadurch Proben, die den Bedingungen in vivo näherkommen und somit biologisch relevantere Ergebnisse in nachgelagerten Analysen ermöglichen.

Die hohe Effizienz der vorgestellten Methode führt zu einer deutlichen Steigerung der Proteinausbeute gegenüber manuellen Verfahren. Zusätzlich zeigten Stabilitätsuntersuchungen, dass in Nanodiscs eingebettete Proteine über längere Zeiträume und auch unter anspruchsvolleren Bedingungen stabil bleiben.

Die automatisierte PlateX MP^TM-Methode ermöglicht darüber hinaus ein effizientes Screening des für das jeweilige Protein und die geplante Folgeanwendung am besten geeigneten Copolymers. Dies ist insbesondere für empfindliche und kostenintensive Anwendungen wie die Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) von großer Bedeutung, bei denen die Auswahl der optimalen Copolymer-Chemie und geeigneter physikochemischer Eigenschaften des Proteins entscheidend ist.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Kombination aus CyBio FeliX und PlateX MP^TM die Gewinnung biologisch relevanter Ergebnisse unterstützt, indem sie die Membranproteinaufreinigung in einen standardisierten, skalierbaren Routineprozess überführt. Gleichzeitig werden hohe Proteinausbeuten erzielt, sodass qualitativ hochwertige Proben direkt für nachgelagerte Analysen zur Verfügung stehen.

Referenzen

1. Hanisch, P.T., et al., Membrane Proteins at Scale: Automated Copolymer Nanodisc Purification for Structure and Function. bioRxiv, 2025

Danksagung

Dieses Protokoll wurde von Applikationsspezialisten von Analytik Jena entwickelt und ist ausschließlich für Forschungszwecke bestimmt. Anwender sind selbst dafür verantwortlich, die Eignung des Protokolls für ihre jeweilige Anwendung zu bewerten.

NativeMP^TM und PlateX MP^TM wurden von Cube Biotech entwickelt und sind geistiges Eigentum von Cube Biotech.

Das automatisierte CyBio-FeliX-Protokoll wurde von Kaja Reiffert (Cube Biotech), Stefano Manduzio (Analytik Jena) und Brian Seitz (Analytik Jena) entwickelt. Die Proteinanalysen wurden von Kaja Reiffert (Cube Biotech), Artem Evdokimov (Orogen Therapeutics) und Valentina Shchedrina (Orogen Therapeutics) durchgeführt.

Hinweis zu Markenzeichen: Die im Anwendungsprotokoll genannten Markennamen von Produkten Dritter sind in der Regel eingetragene Marken der jeweiligen Unternehmen oder Organisationen.

Dieses Dokument entspricht zum Zeitpunkt der Veröffentlichung dem aktuellen Stand; die darin enthaltenen Informationen können sich ändern. Die Methoden wurden unter Verwendung der folgenden Softwareversionen entwickelt und getestet: CyBio Composer Version 2.70, CyBio FeliX Firmware 4.52.00, Pipettierkopf-Firmware CyBio-LPK 3.71.005.

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