02.09.2019

Bestimmung von Kohlenhydraten mit HPLC und elektrochemischer Detektion



Kohlenhydrate gehören zu den am weitesten verbreiteten organischen Verbindungen in der belebten Natur. Als Mono- und Di-Saccharide dienen sie vornehmlich der direkten Energieversorgung im Organismus. Als Oligomere oder Polymere sind sie eher Speicherform für Energie oder Informationen oder übernehmen Aufgaben als Strukturelement in Zellwänden vornehmlich von Pflanzen.

Wegen ihrer großen Bedeutung im Bereich der ökologischen, biologischen, klinischen und Ernährungsforschung ist die Bestimmung von Zuckern und anderen Kohlenhydraten von hohem Interesse. Es gibt eine Reihe unterschiedlicher Bestimmungsmethoden, die oftmals apparativ kostspielig sind wie beispielsweise HPLC-MS oder kompliziert in der Durchführung wie GC mit Derivatisierung.

Standard-HPLC reicht für die Zuckeranalytik nicht aus

An der Trennung der Zucker liegt es nicht. Diese gelingt sehr gut auf einem HPLC-System mit Hilfe der Hochleistungs-Anionenaustauschchromatografie (HPAEC), denn geringe Unterschiede in den pKa-Werten der Kohlenhydrat-Hydroxylgruppen bewirken mit stark alkalischen Eluenten eine unterschiedliche Retention der Saccharide an einem Anionenaustauscherharz.

Die Herausforderung liegt eher bei der Detektion. UV- oder Fluoreszenz-Detektion, die in der Flüssigkeitschromatografie weit verbreitet sind, können wegen fehlender Chromophore bei Zuckern in der Regel nicht eingesetzt werden. Brechungsindex-Detektion ist sehr einfach in der Anwendung, jedoch nur wenig empfindlich und somit nicht für die Bestimmung niedriger Zuckergehalte einsetzbar. Mit einem Derivatisierungsschritt, der einen Chromophor bildet, können die spektroskopischen Verfahren zwar für die Zuckeranalytik einsetzbar werden, dies benötigt jedoch zusätzliche Geräte, Chemikalien und Arbeitsschritte.

Ein alternativer Ansatz macht sich zunutze, dass Kohlenhydrate elektrochemisch reagieren können. Dadurch lassen sie sich sehr empfindlich und selektiv amperometrisch detektieren. Die Amperometrie gehört in der quantitativen Analyse zu den Bestimmungsmethoden mit sehr hoher Empfindlichkeit. Dabei wird ein Elektrolysestrom an einer Arbeitselektrode unter konstant gehaltenem elektrochemischem Potenzial gemessen. Der Elektrolysestrom ist proportional zur Konzentration des oxidierten/reduzierten Analyten. Allerdings ist die klassische Amperometrie ist ein diskontinuierliches Verfahren und daher so nicht direkt mit HPLC einsetzbar.

Im Zuckeranalyse-Chromatografiesystem von KNAUER kommt gepulste amperometrische Detektion (PAD) zum Einsatz, eine Variante, die eine schnelle Messung inkl. der bei Zuckerdetektion notwendigen Regeneration der Elektrode in einer kleinen Messzelle ermöglicht. Ein Zyklus aus Messung, Desorption und Regeneration der Elektrode benötigt nur eine halbe Sekunde und wird während der Analyse ständig wiederholt. So kann wie bei anderen Durchflussdetektoren ein Chromatogramm mitgezeichnet werden. Das Verfahren kommt außer dem frisch bereiteten wässrigen basischen Eluenten ohne zusätzliche Chemikalien aus.

Analyse von Monosacchariden und Uronsäuren aus Holz

In der Forschung für regenerative Roh- und Treibstoffe, die nicht in Konkurrenz zur Nahrungsmittelerzeugung stehen sollen, spielen Zucker aus Holz- und Pflanzenabfällen eine wichtige Rolle. Um die Prozesse zu überwachen oder die Qualität der Produkte zu ermitteln, ist eine empfindliche und zuverlässige Analytik notwendig.

Ein Gemisch aus Monosacchariden und Uronsäuren kann mit der Hochleistungs-Anionenaustausch-Chromatografie (HPAEC) basisliniengetrennt und mit gepulster amperometrischer Detektion (PAD) mit sehr hohem Signal/Rausch-Verhältnis (S/N) bestimmt werden. Die Methode eignet sich auch bei geringen Analyten-Konzentrationen für eine reproduzierbare Analyse.

Neben der Erforschung von Biokraftstoffen sind die Zucker auch Bestandteile zahlreicher Prozesse in Lebensmittelanwendungen und der Natur. Somit eignet sich dieses Verfahren für verschiedene Bereiche, in denen Kohlenhydrate spezifisch getrennt und analysiert werden müssen.

Quelle: KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH




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